肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、范围
本指导原则所述肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的核酸检测技术，以肿瘤个体化治疗相关的突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。
本指导原则所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常及核糖核酸（RNA）表达异常等广义的基因突变。
本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于高分辨熔解曲线PCR方法、Luminex平台或核酸检测芯片等其他基于PCR的分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，申请人可以根据实际产品特性选择适合的方法或补充需要的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本指导原则所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列测定、染色体核型分析及免疫组化技术等用于肿瘤个体化治疗指导的其他方法学。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因突变类型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的突变基因与个体化治疗方案的相关性，说明理论依据。
提交的资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。
（二）产品说明书
说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书中相关技术内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。需要强调的是，产品说明书内容应与申请人前期完成的分析性能评估、稳定性研究、临床实验研究等技术资料完全一致。
1.【预期用途】
应至少包括以下几部分内容：
1.1临床背景的介绍，包括相关适用人群特征、肿瘤的组织类型、适用的样本类型、待测靶基因序列的特征及选择依据，靶基因及其表达蛋白在恶性肿瘤发生、发展过程中可能起到的作用，相关药物或其他治疗技术及其作用机理、与待测突变位点可能存在的关系等。
如申报试剂未与具体治疗方案联合进行相应的临床试验研究，关于靶基因突变与肿瘤疾病及治疗方案的相关性描述仅仅来自诊疗指南、书籍、文献等资料，则在本项下应注明参考资料的出处，预期用途的相关表述中不应涉及具体药物产品（商品）名称、生产企业信息等，并注明未将该产品与具体药物联合进行临床试验，仅针对靶基因突变的检测性能进行了验证；若已将试剂盒与具体药品联合进行了相关临床试验，并证明其具有指导治疗的临床意义，则可在此明确具体药物，并在说明书中对相关的临床研究情况进行简介。
1.2试剂盒用于特定肿瘤患者人群，通过检测人体样本提取的核酸组分中是否存在靶基因突变，对临床上特定肿瘤患者的个体化治疗提供参考意见。肿瘤的类别及适用样本类型应结合实际的临床研究完成情况进行确认。
1.3明确说明该试剂盒仅用于对特定肿瘤患者靶基因序列的检测，其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。
2.【检验原理】
2.1对试剂盒检测能够覆盖的所有突变位点或突变类型进行详细描述（靶序列长度、基因座位、突变类型及相关特征等），对引物及探针设计、不同样品反应管组合、对照品设置及荧光信号检测原理等进行逐项介绍。
2.2核酸分离/纯化方法、原理等。
2.3试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如添加了相关的防污染组分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也应对其作用机理作适当介绍。
3.【主要组成成份】
3.1详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、内容物、比例或浓度等信息，阴性/阳性对照品（或质控品）可能含有生物源性物质的组分，应说明其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
3.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称、注册证号（如有）及其他必要的信息。
3.3如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及该产品的医疗器械注册证号（如有）等详细信息。
4.【储存条件及有效期】
试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等。
5.【适用仪器】
所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
6.【样本要求】
重点明确以下内容：
6.1对适用的样本类型作详细介绍，包括样本来源及取材要求、样本处理方式（如组织样本的固定及包埋方式）、肿瘤细胞比例等。
样本的取材及处理方式等若有通用的技术规范或指南，则应遵循，并在此处引用。
6.2样本处理及保存：核酸分离/纯化前样本的预处理、保存条件及期限（短期、长期）、运输条件等。
6.3在核酸分离/纯化过程结束后，应采用适当方法对分离/纯化后的核酸储备液进行质量控制。比如，采用分光光度计法对分离/纯化后的核酸储备液进行浓度、纯度检测，并依据性能验证结果在此给出用于扩增试验的核酸溶液浓度范围要求。举例：扩增反应终体系中需要50ng的脱氧核糖核酸（DNA）量，而在终体系中需加入25μL的DNA储备液，则在DNA分离/纯化完成后应将DNA储备液的浓度调整至2ng/μL的浓度。
如分离/纯化后的核酸储备液质量（如浓度范围）不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸分离/纯化。
6.4操作过程中各种制备液的稳定性要求，如各类混合液（Mix）、DNA/RNA储备液、反应终体系等(常温/冷藏/冷冻/冻融次数限制等）。
7.【检验方法】
详细说明实验操作的各个步骤，包括：
7.1试剂配制方法、注意事项。
7.2详述核酸分离/纯化的条件、步骤及注意事项。对照品（质控品）应参与样本核酸的平行提取（如有必要），以对核酸分离/纯化环节进行合理的质量控制。
7.3扩增反应前准备：各组分加样体积、顺序、相关注意事项等。
7.4逆转录过程（如涉及）的温度和时间设置、PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置及相关注意事项。
7.5仪器设置：特殊参数，待测基因、内标和对照品的荧光通道选择等。
8.【参考值（参考范围）】
参考值（参考范围）的描述包括基线的确定方法和阈值循环数（Ct）的要求（如适用）。除Ct值要求外，建议结合是否出现典型S形曲线对结果进行判断。
9.【检验结果的解释】
结合阳性对照、阴性对照以及样本管中靶基因和内标的检测结果（Ct值），对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。如存在检测灰区，应对灰区结果的处理方式一并详述。
10.【检验方法的局限性】
10.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者个体化治疗的选择应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
10.2阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞过少、核酸过度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。
10.3肿瘤组织（细胞）可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的检测结果。
10.4不合理的样本采集、转运及处理，以及不当的试验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。
10.5明确该检测仅限于规定的样本类型及检测系统（包括适用机型、核酸分离/纯化试剂、检测方法等）。
11.【产品性能指标】
详述以下性能指标：
11.1对相应国家参考品（如有）检测的符合情况。
11.2最低检测限：说明在试剂盒规定的检测条件及扩增体系中，试剂盒能够覆盖的所有突变类别的最低检出浓度，重点考虑原始模板中突变基因的百分率和扩增终体系中核酸浓度两个因素对最低检测限的影响；并简单介绍最低检测限的确定方法。
11.3企业内部阳性/阴性参考品符合率，阳性/阴性参考品的组成、来源、浓度梯度设置以及评价标准等信息。
11.4精密度：精密度参考品的组成、来源、浓度梯度要求及评价标准，不同浓度精密度参考品的检测结果（变异系数）。
11.5分析特异性
11.5.1野生型验证：应采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，其结果应均为阴性。
11.5.2试剂盒内交叉反应：如考核试剂包括对多个突变位点的检测，则应对该试剂盒覆盖范围内的所有突变类型间进行交叉反应验证。
11.5.3序列相近或具有一定同源性的其他较常见突变或野生型基因序列间的交叉反应验证。
11.5.4潜在干扰物质验证。
如果经验证发现某些序列与靶序列的交叉反应出现阳性结果，则应该对存在交叉反应的核酸序列及浓度进行验证并在产品说明书中表明这种假阳性发生的可能，做出相关的提示。
11.6对比试验研究（如有）：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。
12.【注意事项】
应至少包括以下内容：
12.1如该产品含有人源或动物源性物质，应给出具有潜在感染性的警告。
12.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号或现行有效版本）等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。
（三）拟定产品标准及编制说明
拟定产品标准应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关规定。另外，对于国产试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。附录中应将待测靶基因的基因位点、引物/探针设计及来源、参考品设置、来源及验证情况、各种酶的来源、特性及验证等重点内容予以明确。
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的注册检测应主要包括以下性能指标：物理性状、试剂盒内阴/阳性对照品（质控品）的Ct值要求（包括内标）、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限等。阳性参考品主要考察对试剂盒覆盖范围内不同突变基因的检测符合性，阴性参考品则重点对申报试剂的分析特异性进行验证。
如果申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于国家/行业标准的要求。
（四）注册检测
根据《办法》的要求，首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理总局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续3个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家标准品的检测项目，在注册检测时应采用相应的国家标准品进行,对于目前尚无国家标准品的项目，生产企业应建立自己的参考品体系并提供相应的内部参考品。
（五）主要原材料研究资料
应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交工艺验证报告；如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。
1. 核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
2. PCR和/或逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：
2.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；应提交对纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。
2.2引物
由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化。需提供对分子量、纯度、稳定性、功能性实验等的验证资料。如为外购，还应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。
2.3探针
特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化，在5-端(和/或3-端)进行标记，并经HPLC或其他适宜方法纯化，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱，应对探针的分子量、纯度及标记的荧光素进行核实，并进行功能性试验验证。
2.4酶
DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性；逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。应对酶活性进行合理验证。
3. 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
4. 企业内部参考品：应详细说明有关企业内部参考品的原料选择、制备、定值过程等试验资料。具体要求如下：
4.1阳性参考品
试剂盒（分型或不分型）所能覆盖的所有突变位点均应设置相应的阳性参考品，每个突变位点设置至少三个突变百分率梯度，其中需包括至少一份弱阳性参考品。阳性参考品的突变形式及浓度需经过金标准方法或已上市同类分型试剂的确认。
如申报试剂用于DNA样本的检测，则阳性参考品可以采用临床样本提取的DNA储备液、相应质粒或细胞系（如有）作为原料。如申报试剂用于RNA样本的检测，阳性参考品可以采用临床样本提取的RNA储备液、相应RNA冻干粉或模拟缺陷病毒（假病毒）的形式；如覆盖突变位点过多，可以对其中部分突变位点采用质粒的形式，但不能全部采用质粒，需包括部分突变类型（申请人自行确定其代表性）RNA为模板的阳性参考品以对逆转录（RT）过程进行监控。
4.2阴性参考品
可采用经确认无相应靶突变序列的野生型DNA储存液。
4.3检测限参考品
检测限参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有的突变类型。在进行最低检测限性能评估时，应设置多个梯度，主要从扩增反应终体系核酸浓度和突变序列所占百分率两个方面进行评价，建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。当设置检测限参考品时，可以仅设置一个浓度水平，该水平可略高于95%的阳性检出率水平，而设置为100%检出，应明确参考品中靶核酸浓度水平和突变百分率。
4.4精密度参考品
精密度参考品原料要求参考阳性参考品，需至少包括弱阳性、中或强阳性水平的精密度验证，中/强阳性精密度参考品可不必包括所有突变类型，以常见突变类型（申请人自行确定其代表性）为主，但弱阳性参考品需包括所有突变位点；如有必要，建议同时设置阴性参考品精密度验证。
5. 试剂盒内对照品（质控品）
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸分离/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。所有阳性对照品的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为DNA或RNA。对照品可采用质粒、假病毒或临床样本的核酸提取液等进行配置。申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。申请人应视申报产品具体情况设置合理的试剂盒对照品（质控品），试剂盒质控体系主要考虑以下几方面要求。
5.1阳性对照品（质控品）
建议对每个样品反应管设置至少一份阳性对照品（质控品），阳性对照品应参与样本核酸的平行提取（如有必要），以对样本核酸分离/纯化、试剂及仪器性能、扩增反应过程等环节进行质量控制，企业应对各种阳性对照品（质控品）的Ct值做出明确的范围要求。如样本反应管内可以覆盖多种突变序列的检测（分型或不分型），相应的阳性对照管可以不必涉及所有突变类型，但应选择较常见突变序列或理论上较难测得的突变序列作为阳性对照。
5.2内对照（内标）
内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，尤其是靶核酸为RNA、用于基因重排或基因表达异常等检测目的时，可以采用管家基因或与靶基因浓度水平相当的其他基因序列作为相应的内对照（内标）。申请人应对内对照（内标）的引物、探针和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制而导致假阴性。
5.3阴性对照
阴性对照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白对照，以对可能存在的交叉污染进行假阳性结果的质控。阴性对照品应参与样本核酸的平行提取。
由于临床标本多为经过复杂处理的病理切片或组织，其中核酸的完整性容易被破坏，从而影响后续实验结果，造成假阴性的可能性。因此，除上述对照品外，申报试剂的反应体系中应充分考虑对核酸分离/纯化环节的质量控制，比如，设置专门的质控管对管家基因或其他源于人类基因组DNA的靶序列进行扩增，以对核酸分离/纯化的质量及效率进行评估。
（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料
生产工艺及反应体系的研究资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置、Ct（临界）值确定等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率、离子浓度等关键参数进行有效控制。主要包括以下内容：
1. 主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。
2. 反应原理介绍。
3. 基因位点选择、(RT)-PCR方法学特性介绍。
4. 确定最佳(RT)-PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度等。
5. 确定逆转录过程（如涉及）的温度和时间的研究资料，PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
6. 对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。
7. 不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。
8. 如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。
（七）分析性能评估资料
企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。若试剂用于RNA样本检测，则在性能评估中（除非特别说明）需对所有突变位点均采用RNA样本，从而对逆转录过程进行验证。
建议着重对以下分析性能进行研究。
1. 样本核酸分离/纯化
样本核酸的分离/纯化主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，样本核酸分离/纯化是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。尤其是石蜡包埋组织样本在福尔马林固定过程中，会使样品中的核酸与核酸之间，核酸与蛋白之间发生交联，并且样本在不当的保存条件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分离/纯化的难度。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应对核酸分离/纯化的环节做充分的验证。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
2. 阳性/阴性参考品符合率
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应Ct值的限制；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性；如有野生型参考品的设置，在其相应的引物探针组合下检测应为阳性。
3. 最低检测限
建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准，扩增反应终体系中的突变序列百分率和总核酸浓度两个因素对最低检测限的影响较大，终体系中突变序列的百分率越高、所含的DNA（RNA）量越多，则越容易检出。因此，试剂盒最低检测限主要考虑以下两种情形。
3.1在扩增反应终体系特定核酸浓度下，突变序列所占百分率的最低检测限。
采用野生型临床样本和较高突变百分率的临床样本提取的核酸储备液进行混合，确定扩增反应终体系中的核酸浓度，采用合理的试验方法（如深测序）对混合后样本中突变序列所占百分率进行确认，并逐渐调整野生型和突变型核酸储备液的比例以得到含不同突变序列百分率的混合液。如上述方法不易实现，也可采用含相应突变类型的质粒与野生型基因组DNA（或野生型质粒）混合的方法来制备相应的混合液。对各份混合液进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率水平，作为在固定的核酸浓度条件下，可以检测到的最低的突变序列百分率。
举例：在50ng/40μL水平，可以达到95%阳性检出率的最低突变序列百分率为10%。
3.2在特定突变序列百分率下，反应终体系中核酸浓度的最低检测限。
采用合理的实验方法确定待测样本中的突变序列所占的百分率，或采用突变型质粒与野生型基因组DNA（或野生型质粒）按一定比例混合（如固定在10%的水平），再逐级稀释成不同核酸浓度样本，分别对各梯度浓度样本进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率的最低DNA（RNA）浓度。
举例：在10%的突变序列百分率水平，40μL扩增反应终体系中，DNA浓度的最低检测限为50ng/40μL。
3.3建议评价肿瘤细胞比例、DNA（RNA）降解等因素对最低检测限可能造成的影响。
4. 分析特异性
4.1野生型验证：采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，结果应为阴性。
4.2交叉反应，对于此类产品的交叉反应验证主要考虑以下几方面情形：
4.2.1申报试剂所覆盖的全部突变类型间的交叉反应；
4.2.2核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反应的野生型或其他突变类型序列间的交叉反应。
申请人应提供所有用于交叉反应验证的突变或野生型序列来源、序列确认和浓度选择等试验资料。有关交叉反应验证的信息应在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
4.3干扰物质
4.3.1申请人应根据试剂盒所采用的样本类型，确定潜在的干扰物质。
4.3.2用于干扰试验的样本，靶基因浓度应至少包含弱阳性，而不应仅选择强阳性样本，使用医学相关水平的干扰物质进行验证。此外，建议申请人同时在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下同样进行评价。
有关干扰物质的研究结果亦应总结于产品说明书的【产品性能指标】项下。
5. 精密度
测量精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考国际或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
5.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。
5.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
5.3用于精密度评价的参考品应至少包括弱阳性参考品和高浓度参考品2个水平，如有必要，建议同时设置阴性参考品进行验证，要求如下:
5.3.1阴性参考品：待测靶核酸浓度低于最低检测限或为零浓度，建议选用背景值较高的阴性样本，阴性符合率应为100%（n≥20）。
5.3.2弱阳性参考品：待测靶核酸浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应达到100%（n≥20）。（弱阳性参考品需包括所有的突变位点，如果待测物靶核酸为RNA，则弱阳性精密度参考品中应至少部分典型突变位点的原料为RNA，如RNA干粉或相应的假病毒）
5.3.3高浓度参考品：待测靶核酸呈中到强阳性的浓度，阳性检出率为100%且CV≤15%（n≥20）。（如果试剂盒可以覆盖多个突变位点的检测，该参考品可以设置为对全部突变位点进行精密度验证，也可以选择其中部分突变位点进行验证，但应至少包含常见突变序列或理论上较难测得的突变序列）
6. 其他需注意问题
对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用仪器】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。若试剂盒适用的样本类型不止一种，如既包含石蜡包埋组织切片亦包含冷冻组织切片或血液样本等，则需对所有样本类型的适用性进行评估，并提交评估资料。
（八）参考值（参考范围）确定资料
对于此类试剂，参考值确定资料主要是指Ct值的确认资料，建议申请人采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。
（九）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括效期稳定性（有效期）、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于效期稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
另外，样本稳定性的研究对于实验的成败也至关重要。特别是当使用标本类型包括组织标本时，肿瘤组织标本经过特殊处理后其核酸序列的完整性容易遭到破坏，因此应提供对样本保存条件、保存时间等方面的详细研究资料。样本稳定性研究主要包括核酸分离/纯化前样本稳定性和分离/纯化后核酸在储备液中的稳定性两方面。在合理的温度范围内选择多个温度点（应至少包括范围的上限和下限温度），每间隔一定的时间段即对储存样本进行分析验证，从而确认不同类型样本的稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
（十）临床试验研究
对于国内外尚无同类产品被批准上市或无充足资料证明其临床预期用途的新型肿瘤相关基因突变，相关检测试剂的临床研究不能单纯采用对比试验的方法，而应将试剂盒临床研究纳入相关药物的临床研究或临床应用中，通过对特定的肿瘤病人进行治疗前后的跟踪随访，以临床对于患者个体化治疗方案及有效性的综合判断为金标准，评价此类试剂用于指导肿瘤个体化治疗的临床性能。其中，有关诊断试剂临床研究的临床试验资料应符合《办法》、《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）以及《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求。
对于已有同类产品上市的、基因突变类型与肿瘤个体化治疗方案的相关性已经得到确认的产品，则申请人既可采用试剂盒检测与相关药物治疗相结合对特定的肿瘤病人进行治疗前后的跟踪临床研究的方法，亦可在充分结合相关的病例信息的情况下，采用考核试剂与参比方法进行对比试验的研究方法，对考核试剂的临床应用有效性进行评价。
以下要求均针对采用对比试验方法的临床研究提出。
1. 参比方法的选择可以考虑以下几方面：
1.1如已有同类产品上市，其临床研究可以选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。但应充分考虑已上市同类试剂的突变位点选择、靶序列选择、最低检测限等特性，确保考核试剂与申报试剂具有明确可比性。
1.2申请人亦可采用核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的参比方法，验证考核试剂检测结果与核酸序列测定（测序）结果之间的一致性情况。临床研究报告中应对选用的测序方法作详细介绍，并对委托测序服务的机构（如涉及）资质和选择依据作简要说明或提供相关资料。
申请人应提供以下关于测序部分的详细试验资料，需有临床试验单位或委托测序服务机构的签章确认。
1.2.1测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。
1.2.2测序方法所用引物相关信息，如基因区段选择，分子量、纯度、功能性实验等资料。引物设计应合理涵盖考核试剂扩增的靶核酸区段、位点、及所有突变类型。
1.2.3对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报试剂的相关性能进行适当比对分析。
1.2.4测序方法应建立合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进行质量控制。
1.2.5提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
1.3此外，在充分考虑检测结果具有明确可比性的前提下，也可以选择荧光原位杂交（FISH）或免疫组化等染色体或蛋白水平的检测技术作为参比方法，但考虑到检测结果之间不具有直接的可比性，建议对所有阳性病例采用其他分子生物学技术（如核酸序列测定）对结果予以确认。测序部分资料的提交参考上一条要求。
2. 临床研究单位的选择
建议申请人在选择临床单位时，应在国内不同区域选择临床单位，尽量使各单位的临床样本有一定的区域代表性；临床研究单位应具有分子病理诊断和分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和参比方法都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
3. 临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的参比试剂应完全一致，以便进行合理的统计学分析。临床方案中还应明确复核试剂及方法。另外，考核试剂适用的样本类型、可检测的基因突变类型不应超越参比试剂的相应检测要求，若此种情况发生，则应选择其他合理参比方法对额外的样本类型和基因突变类型进行验证。
4. 病例选择及阳性病例比例
临床试验应以肿瘤患者为研究对象，其中试剂盒规定范围的每种突变类型均应有一定量的阳性病例。对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应验证的需要，以从临床角度考察其分析特异性。阴/阳性病例均应覆盖所有适用的肿瘤类型。若产品适用于多种样本类型，则应对所有样本类型均进行临床验证。
5. 统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、受试者工作特征（ROC）曲线分析、阴性/阳性符合率等。对于本类产品对比实验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表χ2检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果有无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
6. 结果差异样本的验证
在数据收集过程中，对于两种方法检测结果不一致的样本，应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。
7. 临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
7.1临床试验总体设计及方案描述
7.1.1临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
7.1.2病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准。
7.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存等。
7.1.4统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
7.2具体的临床试验情况
7.2.1临床研究所用产品的名称、批号、有效期及所用机型等信息，以及对比试验产品的注册情况。
7.2.2对各研究单位的病例数、年龄分布情况进行综合分析，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
7.2.3质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、质控品运行情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
7.2.4具体试验过程，样本检测、数据收集、样本保存、结果不一致样本的校验等。
7.3统计学分析
7.3.1数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
7.3.2阳性符合率、阴性符合率、总体符合率。
7.3.3以交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表χ2检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。
另外考虑到对不同样本类型以及不同年龄段人群的检测结果可能存在一定差异，故建议对不同样本类型及不同年龄段人群分别进行统计分析，以对考核试剂的临床性能进行综合分析。
7.4讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
三、名词解释
1. 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR：
聚合酶链式反应或多聚酶链式反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。
2. 杂交 hybridization
具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）可以通过氢键的方式，按碱基互补配对原则相结合。
3. 荧光探针PCR
在PCR过程中利用荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量进行分析的PCR。
4. 分析特异性 analytical specificity
测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述，并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度。（潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物）
5. 精密度 precision
在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。
6. 检测限 detection limit, limit of detection
样品中以一定概率可被声明与零有差异的被测测量的最低值。
7. 阈值循环数 cycle threshold, Ct
实时监测扩增过程中，反应管内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct）。
8. 突变 mutation
是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的可遗传的改变。
9. 内标 internal control
在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子，其目的是鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。
四、参考文献
1. 《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》,（国食药监械〔2007〕229号）,2007年4月19日。
2. 《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》,（国食药监械〔2007〕240号）,2007年4月28日。
3. 《体外诊断试剂说明书编写指导原则》,（国食药监械〔2007〕240号）,2007年4月28日。
4. Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection or Detection and Differentiation of Influenza Viruses. CDRH, FDA, USA, February 15, 2008。
5. 彭文伟.传染病学,第五版.人民卫生出版社，2001。
6. 李金明.实时荧光PCR技术,第一版.人民军医出版社, 2007。
7. Robert F. Weaver. Molecular Biology, 4th Edition, 2008。
8. 刘艳芳,张勇建,苏明.临床病毒学检验.军事医学科学出版社,2009。
9. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS), MM3-A2, Vol26 No.8, ISBN 1-56238-596-8。
10. Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline. NCCLS, MM6-A, Vol. 23 No.28. ISBN 1-56238-508-9。
11. Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS), MM17-A, Vol.28 No.9, ISBN 1-56238-661-1。
12. 冯仁丰.临床检验质量管理技术基础,第二版.上海科学技术文献出版社,2007。
13. 《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社。
14. T.斯特罗恩，A.P.里德 编著. 孙开来 主译. 人类分子遗传学,第三版. 北京：科学出版社,2007。
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂
技术审查指导原则编制说明
一、背景信息
近年来，肿瘤的治疗取得了相当大的进展，然而，在肿瘤的治疗中，无论是疗效还是毒性反应都存在较大的个体差异。即使是同一个部位的肿瘤，相同的治疗方法对不同的个体也会导致不同的治疗结果。如用于治疗非小细胞型肺癌的药物吉非替尼，绝大多数的非小细胞肺癌病人对吉非替尼无反应，但约10%的病人对吉非替尼表现出快速且非常显著的疗效。研究发现，EGFR基因18-21号外显子序列发生突变后会使吉非替尼的疗效更好。在临床上通过检测肿瘤患者，肿瘤组织中基因突变靶点及基因单核苷酸序列多态性（SNP）分型、基因重排、基因拷贝数异常、核糖体核糖核酸（mRNA）表达异常等为临床提供个体化治疗的依据，能显著提高治疗的效率，降低药物的毒副作用。目前用于肿瘤个体化治疗相关基因突变的检测还有：CYP2C19基因检测、HER-2基因检测、K-ras基因检测等。进行肿瘤个体化治疗的基础和前提是肿瘤分子靶标检测结果的准确性。多种原因会影响检测结果的准确性，包括检测试剂的方法学上的局限性，检测试剂原材料的设计和选择等，除此之外，样本质量对检测结果也有影响，如：样本中核酸的分离/纯化过程、样本中不可避免的一些干扰物质等。假阳性的检测结果不仅使患者的治疗达不到预期的效果，还会使病人承受不必要的痛苦；而假阴性的检测结果会给临床医生错误的用药指导，使病人错过最佳的治疗时机，最终导致病人病情的恶化，甚至死亡。因此相关的生产企业必须充分意识到该类产品的潜在风险，根据本指导原则的要求对该类试剂的安全性和有效性进行科学合理的验证。
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的核酸检测技术，以肿瘤个体化治疗相关的突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组份中的目标序列进行体外检测的试剂。
二、编制目的
目前，涉及肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂研制及注册申报的生产企业众多，但不同厂家的产品在扩增引物、荧光探针的设计及临床验证等方面差异较大，分析性能明显不一，虽然《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（以下简称《办法》）、《体外诊断试剂说明书编写指导原则》、《体外诊断试剂临床研究指导原则》等体外诊断试剂法规文件对该类试剂的注册申报资料提出了原则性要求，但在技术审评环节中仍然遇到许多细节性技术问题有待统一。随着技术审评工作的不断积累，对该类产品的技术要求以及存在问题也逐渐明确，因此，有必要制定相关的技术指导原则对这些共性问题进行总结规范。
本指导原则旨在让申请人明确审评部门对本类试剂重点关注的内容、规范注册申请人对注册申报资料的准备及撰写、解释企业在注册申报过程中对一些常见问题的疑惑、尽量减少技术审评环节的注册资料补充，同时有利于规范技术审评要求，统一审评尺度。本文内容不包括注册审批的行政事项，亦不作为法规强制执行。企业在实际操作过程中可以采用其他合理方式，但应有充分的证据说明其所用方法可以有力保证试剂的安全有效性。
三、重点技术问题的说明
（一）产品说明书中针对【预期用途】、【样本要求】、【检验方法】、【检验结果的解释】及【检验方法的局限性】等项目增加了有关肿瘤个体化治疗相关基因突变检测的特殊说明。在【样本要求】部分对本类试剂在检测过程中所需样本的特殊要求及对样本处理过程的质量控制进行了明确，在【检验方法的局限性】部分，专门对由于非试剂原因造成的假阳性或假阴性结果进行了可能性的分析。
（二）主要原材料的研究资料中包含内对照。
内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，尤其是靶核酸为RNA、用于基因重排或基因表达异常等检测目的时，可以采用管家基因或与靶基因浓度水平相当的其他基因序列作为相应的内对照（内标）。申请人应对内对照（内标）的引物、探针和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制而导致假阴性。
（三）明确提出对样本核酸分离纯化的要求。
样本核酸的分离/纯化主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，样本核酸分离/纯化是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。尤其是石蜡包埋组织样本在福尔马林固定过程中，会使样品中的核酸与核酸之间，核酸与蛋白之间发生交联，并且样本在不当的保存条件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分离/纯化的难度。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应对核酸分离/纯化的环节做充分的验证。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
（四）分析特异性包括野生型验证和交叉反应两部分，前者为采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，结果应为阴性。后者主要包括以下两个方面，其一，申报试剂所覆盖的全部突变类型间的交叉反应；其二，核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反应的野生型或其他突变类型序列间的交叉反应。申请人应提供所有用于交叉反应验证的突变或野生型序列来源、序列确认和浓度选择等试验资料。有关交叉反应验证的信息应在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
（五）阳性/阴性参考品。
如申报产品有相应的国家参考品，则企业内部阳性/阴性参考品应参考国家参考品的项目设置。在不低于国家参考品要求的前提下，申请人可以结合实际情况设置合理的企业内部阳性/阴性参考品。对于没有国家参考品的产品，申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品，应着重考虑试剂盒（分型或不分型）所能覆盖的所有突变位点均应设置相应的阳性参考品，每个突变位点设置至少三个突变百分率梯度，其中需包括至少一份弱阳性参考品。阳性参考品的突变形式及浓度需经过金标准方法或已上市同类分型试剂的确认。
（六）临床试验参比方法的选择可以是境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，也可选择核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的参比方法。此外，在充分考虑检测结果具有明确可比性的前提下，也可以选择荧光原位杂交（FISH）或免疫组化等染色体或蛋白水平的检测技术作为参比方法，但考虑到检测结果之间不具有直接的可比性，建议对所有阳性病例采用其他分子生物学技术（如核酸序列测定）对结果予以确认。测序部分资料的提交参考上一条要求。
（七）病例选择及阳性病例比例。临床试验应以肿瘤患者为研究对象，其中试剂盒规定范围的每种突变类型均应有一定量的阳性病例。对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应验证的需要，以从临床角度考察其分析特异性。阴/阳性病例均应覆盖所有适用的肿瘤类型。若产品适用于多种样本类型，则应对所有样本类型均进行临床验证。
四、编写单位
国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心。
体外诊断试剂临床试验技术指导原则
附件
体外诊断试剂临床试验技术指导原则
一、概述
体外诊断试剂的临床试验（包括与已上市产品进行的比较研究试验）是指在相应的临床环境中，对体外诊断试剂的临床性能进行的系统性研究。
申请人应在符合要求的临床单位，在满足临床试验最低样本量要求的前提下，根据产品临床预期用途、相关疾病的流行率和统计学要求，制定能够证明其临床性能的临床试验方案，同时最大限度地控制试验误差、提高试验质量并对试验结果进行科学合理的分析。临床试验报告是对临床试验过程、结果的总结，是评价拟上市产品有效性和安全性的重要依据，是产品注册所需的重要文件之一。
本指导原则仅对体外诊断试剂临床试验提出了一般性的要求。由于体外诊断试剂产品具有发展快、专业跨度大、临床预期用途各异的特点，不同临床预期用途产品的临床试验方法及内容不尽相同。申请人应根据产品特点及临床预期用途，制定合理的临床试验方案。国家食品药品监督管理总局也将根据体外诊断试剂发展的需要，适时修订本指导原则。
二、临床试验的基本原则
（一）基本要求
1．临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则,必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。研究者应考虑临床试验用样本，如血液、羊水、胸水、腹水、组织液、胸积液、组织切片、骨髓等的获得或试验结果对受试者的风险性，应提交伦理委员会的审查意见及受试者的知情同意书。对于例外情况，如客观上不可能获得受试者的知情同意或该临床试验对受试者几乎没有风险，可经伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意。
2．受试者的权益、安全和健康必须高于科学和社会利益。
3．为受试者保密，尊重个人隐私。防止受试者因检测结果而受到歧视或伤害。
4．临床前研究结果支持进行临床试验。
（二）临床试验机构及人员的要求
1. 第三类体外诊断试剂申请人应当选定不少于3家（含3家）、第二类体外诊断试剂申请人应当选定不少于2家（含2家）临床试验机构，按照有关规定开展临床试验。
2．体外诊断试剂的临床试验机构应获得国家食品药品监督管理总局资质认可。
3．申请人应根据产品特点及其预期用途，综合不同地区人种、流行病学背景、病原微生物的特性等因素选择临床试验机构。临床试验机构必须具有与试验用体外诊断试剂相适应的专业技术人员及仪器设备，并能够确保该项试验的实施。
4. 申请人应当在临床试验前制定文件明确各方的职责分工，与各临床试验机构协商制定统一的临床试验方案，按照临床试验方案组织制定标准操作规程，并组织对参加试验的所有研究者进行临床试验方案和试验用体外诊断试剂使用的培训，以确保临床试验方案和试验用体外诊断试剂操作的一致性，并在临床试验过程中促进各研究者之间的沟通。
5．在临床试验开始前，申请人应与临床试验工作人员进行临床试验的预试验，使其熟悉并掌握该产品所适用的仪器、操作方法、技术性能等，以最大限度地控制试验误差。
6．在临床试验过程中，申请人应考虑吸收流行病学、统计学、临床医学、检验医学等方面专业人员（或知识），以保证临床试验科学、合理地开展。
三、临床试验设计原则
（一）临床试验方案
开展体外诊断试剂临床试验，申请人应当按照试验用体外诊断试剂的类别、风险、预期用途等特性，组织制定科学、合理的临床试验方案。一般应当包括以下内容：
1. 一般信息（包括产品信息、临床试验开展的时间和人员等相关信息、申请人相关信息等）；
2. 临床试验的背景资料；
3. 试验目的；
4. 试验设计；
5. 评价方法；
6. 统计方法；
7. 对临床试验方案修正的规定；
8. 临床试验涉及的伦理问题和说明、《知情同意书》文本（如有）；
9. 数据处理与记录保存;
10. 其他需要说明的内容。
（二）试验方法
1．新研制体外诊断试剂的临床试验
1.1 对于新研制体外诊断试剂而言，选择适当的受试者，采用试验用体外诊断试剂与诊断该疾病的“金标准”进行盲法同步比较。
对用于早期诊断、疗效监测、预后判断等用途的体外诊断试剂，在进行与“金标准”的比较研究的同时，还必须对受试者进行跟踪研究。研究者应明确受试者的入选标准、随访标准和随访时间。
1.2 “金标准”的确定。
“金标准”是指在现有条件下，公认的、可靠的、权威的诊断方法。临床上常用的“金标准”有组织病理学检查、影像学检查、病原体分离培养鉴定、长期随访所得的结论及临床常用的其他确认方法等。
1.3受试者的选择。
受试者应包括两组：一组是用“金标准”确定为有某病的病例组，另一组是经“金标准”确定或有临床证据证实无该病的患者或正常人群，作为对照组。病例组应包括该病种的不同病例，如症状典型和非典型的，病程早、中、晚期的，病情轻、中、重型的，不同性别、不同年龄层次的等，以便能反映该病的全部特征。对照组应包括确定无该病的患者，及易与本病相混淆疾病的病例。
1.4同步盲法测试。
经“金标准”确定的病例组与对照组中的受试者样本同步接受试验用体外诊断试剂的检测，将检测结果与“金标准”判定的结果进行比较，计算试验用体外诊断试剂检测结果与“金标准”判断结果符合或差异程度的统计学指标，再根据这些指标对试验用体外诊断试剂进行评价。在试验操作的全过程和判定试验结果时，采用盲法（尽可能用双盲法）是保证临床试验结果真实可靠的关键。
2．“已有同品种批准上市”产品的临床试验
选择已上市产品，采用试验用体外诊断试剂与已上市产品针对临床样本进行比较研究试验，证明试验用体外诊断试剂与已上市产品等效。
2.1 对比试剂的选择。
在采用已上市产品作为对比试剂的前提下，选择目前临床普遍认为质量较好的产品。同时应充分了解所选择产品的技术信息，包括方法学、临床预期用途、主要性能指标、校准品的溯源情况、推荐的阳性判断值或参考区间等，以便对试验结果进行科学的分析。
2.2受试者的选择原则同1.3。
2.3对于比较研究试验中测定结果不符的样本，应采用“金标准”或其他合理的方法进行复核，以便对临床试验结果进行分析。如无需复核，应详细说明理由。
3. 关于变更申请中涉及的产品临床试验方法
根据变更情况可能对产品性能带来的影响，采用变更后产品与变更前产品或者已上市同类产品进行对比试验，证明变更后产品与对比试验产品等效。
4．关于进口注册产品临床试验方法
对于进口注册产品，由于目标人群种属和地域的改变，可能影响产品的某些主要技术指标和有效性。申请人或临床研究者应考虑不同国家或者地区的流行病学背景、不同病种的特性、不同种属人群所适用的阳性判断值或者参考区间等诸多因素，在中国境内进行具有针对性的临床试验。
（三）临床试验样本量
申请人或临床研究者应根据产品临床预期用途以及与该产品相关疾病的临床发生率确定临床试验的样本量和样本分布，在符合指导原则有关最低样本量要求的前提下，还应符合统计学要求。各临床试验机构样本量和样本分布应相对均衡。
罕见病及用于突发公共卫生事件的体外诊断试剂可酌减样本量，但应说明理由，并满足评价的需要。
1．一般要求
1.1第三类产品：临床试验的总样本数至少为1000例。
1.2第二类产品：临床试验的总样本数至少为200例。
2．特殊要求
2.1采用核酸扩增方法用于病原体检测的体外诊断试剂：临床试验总样本数至少为500例。
2.2与麻醉药品、精神药品、医疗用毒性药品检测相关的体外诊断试剂：临床试验总样本数至少为500例。
2.3 流式细胞仪配套用体外诊断试剂:临床试验总样本数至少为500例。
2.4 免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒:与临床治疗、用药密切相关的标志物及其他具有新的临床意义的全新标记物，临床试验总样本数至少为1000例;临床使用多个指标综合诊治的标志物之一，与辅助诊断、鉴别诊断、病情监测、预后相关的标志物,临床试验总样本数至少为500例。
2.5 用于血型检测相关的体外诊断试剂:临床试验总样本数至少为3000例。
2.6新研制体外诊断试剂产品的临床试验样本量要求同第三类产品。
2.7 变更事项相关的临床试验:涉及产品检测条件优化、增加与原样本类型具有可比性的其他样本类型等变更事项，第三类产品临床试验总样本数至少为200例,第二类产品临床试验总样本数至少为100例,并在至少2家(含2家)临床试验机构开展临床试验；变更抗原、抗体等主要原材料的供应商、阳性判断值或参考区间的变化及增加临床适应症等变更事项，应根据产品具体变更情况，酌情增加临床试验总样本数。
2.8 国家食品药品监督管理总局制定发布的体外诊断试剂指导原则对临床试验例数有规定的，应参照相应指导原则确定样本数。
（四）临床试验方案签章要求
由各承担临床试验的主要研究者（签名）、临床试验机构（签章）、统计学负责人签名及单位盖章、申请人盖章。
四、关于临床试验报告的撰写
临床试验报告应该对试验的整体设计及其关键点给予清晰、完整的阐述，应该对试验实施过程进行条理分明的描述，应该包括必要的基础数据和统计分析方法。
申请人或临床试验牵头单位应对各临床试验机构的报告进行汇总，并完成临床试验总结报告。临床试验报告的格式及内容如下：
（一）首篇
首篇是每份临床试验报告的第一部分，所有临床试验报告均应包含该部分内容。
1．封面标题
包括试验用体外诊断试剂的通用名称、试验开始日期、试验完成日期、主要研究者（签名）、临床试验机构（盖章）、统计学负责人签名及单位盖章、申请人（盖章）、申请人的联系人及联系方式、报告日期、原始资料保存地点。
2．目录
列出整个临床试验报告的内容目录和对应页码。
3．研究摘要
对临床试验情况进行简单的介绍。
4．试验研究人员
列出临床试验主要研究人员的姓名、单位、在研究中的职责及其简历（列于附件中），主要研究人员包括主要研究者及各单位的主要参加人员、统计学负责人、临床试验报告的撰写人。
5．缩略语
临床试验报告中所用的缩略语的全称。
（二）正文内容和报告格式
1．基本内容
1.1引言。
介绍与临床试验产品有关的背景情况：包括（1）被测物的来源、生物及理化性质；（2）临床预期使用目的，所针对的目标适应症人群，目前针对该适应症所采用的临床或实验室诊断方法等；（3）所采用的方法、原理、技术要求等；（4）国内外已批准上市产品的应用现状等。说明申请人和临床试验机构间的合作关系。
1.2 研究目的。
说明本临床试验所要达到的目的。
1.3 试验管理。
对试验管理结构的描述。
管理结构包括主要研究者、主要参加人员、实验室质量控制情况、统计/数据管理情况以及试验中发生的问题及其处理措施等。
1.4 试验设计。
1.4.1 试验总体设计及方案的描述。
试验的总体设计和方案的描述应清晰、简洁，必要时采用图表等直观的方式。试验进行时方案修改的情况和任何方案以外的信息来源也应详细叙述。
1.4.2 试验设计及试验方法选择。
试验设计中应包括以下内容：
（1）样本量及样本量确定的依据。
（2）样本选择依据、入选标准、排除标准和剔除标准。
（3）样本采集、保存、运输方法等。
（4）“金标准”或对比试剂的确立。
（5）临床试验用所有产品的名称、规格、来源、批号、效期及保存条件，对比试剂的注册情况。
（6）质量控制方法。对质量控制方法进行简要的阐述。
（7）临床试验数据的统计分析方法。
（8）试验过程中方案的修改。
一般情况下，临床试验方案不宜更改。试验过程中对方案的任何修改均应说明，对更改的时间、理由、更改过程及有无备案进行详细阐述并论证其对整个研究结果评价的影响。
1.5 临床试验结果及分析。
1.6 讨论和结论。
2．有关临床试验中特别情况的说明
3．附件
3.1 临床试验中所采用的其他试验方法或其他诊断试剂产品的基本信息，如试验方法、诊断试剂产品来源、产品说明书及注册批准情况。
3.2 临床试验中的所有试验数据，需由临床试验操作者、复核者签字，临床试验机构盖章（封面盖章和骑缝章）。
3.3主要参考文献。
3.4 主要研究者简历。
3.5 申请人需要说明的其他情况等。
五、名词解释
试验用体外诊断试剂，是指临床试验中对其安全性、有效性进行确认或者验证的拟申请注册的体外诊断试剂。
临床试验方案，是指有关临床试验的题目、目的、设计、方法学、统计学考虑和组织等文件，通常也包括试验的背景、理论基础。
研究者，是指负责在一个临床试验机构中实施临床试验的人，如果在一个临床试验机构中是由一组人员实施试验的，则研究者指的是这个组的负责人，也称主要研究者。
受试者，是指被招募参加临床试验的个人，既可以是临床试验中接受试验用体外诊断试剂检测的人员，也可以是对照人员。
知情同意，是指向受试者告知一项试验的各方面情况后，受试者确认自愿参加该项临床试验的过程，必须以签名和注明日期的知情同意书作为证明文件。
知情同意书，是指每位受试者表示自愿参加某一试验的证明性文件。研究者需向受试者说明试验性质、试验目的、可能的受益和风险、可供选用的其他诊疗方法以及符合《赫尔辛基宣言》规定的受试者的权利和义务等，使受试者充分了解后自愿表达其同意参加某项临床试验。
伦理委员会，是指在临床试验机构内由医学专业人员、非医学专业人员组成的独立机构，其职责是对临床试验的科学性和伦理进行审议，具体来说就是对临床试验方案进行审批，对研究人员资格、设施设备以及知情同意的方法等进行审议并提出相关意见，以保证受试者安全、健康和权益得到充分保护。
标准操作规程，是指为有效地实施和完成某一临床试验中每项工作所拟定的标准和详细的书面规程。
《肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂技术审
肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂技术审查指导原则
（征求意见稿）
二零一三年六月
目 录
肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂
技术审查指导原则（征求意见稿）
一、 前言
本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
二、 适用范围
本文所述肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂是指利用荧光探针聚合酶链式反应（PCR）方法，以个体化用药相关的肿瘤突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。
本文所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常及RNA表达异常等广义的基因突变。
本文所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列测定、染色体核型分析及免疫组化技术等用于肿瘤个体化用药指导的其他方法学；本文提出的相关要求亦不完全适用于PCR熔解曲线、Luminex平台或核酸检测芯片等其他分子生物学技术，但有利之处可以参考执行。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
三、 注册申报资料要求
(一)综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同肿瘤突变类型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的突变基因与个体化用药的相关性，说明理论依据。
提交的资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。
(二)产品说明书
说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。
1. 【预期用途】
应至少包括以下几部分内容：
（1） 临床背景的介绍，包括相关适用人群特征、肿瘤的组织类型、适用的样本类型、待测靶基因序列的特征及选择依据，靶基因及其表达蛋白在恶性肿瘤发生、发展过程中可能起到的作用，相关药物及其作用机理，以及药物与待测突变位点可能存在的关系等。如无合理的临床验证，不建议在此涉及具体药物产品（商品）名称、生产企业等信息；若有相关临床验证，可在此明确具体药物，但需在说明书中对相关的临床研究情况进行简介。
（2） 试剂盒用于特定肿瘤患者人群，通过检测人体样本提取的核酸组分中是否存在靶基因突变，对临床上特定肿瘤患者的个体化用药提供参考意见。肿瘤的类别及适用样本类型应结合实际的临床研究完成情况进行确认。
（3） 明确说明该试剂盒仅用于对特定肿瘤患者靶基因序列的检测，其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其它实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。
2. 【检验原理】
（1） 对试剂盒检测能够覆盖的所有突变位点或突变类型进行详细描述（靶序列长度、基因座位、突变类型及相关特征等），对引物及探针设计、不同样品反应管组合、对照品设置及荧光信号检测原理等进行逐项介绍。
（2） 核酸提取方法、原理等。
（3） 试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如反应体系中添加了相关的防污染组分（如UDG酶），也应对其作用机理作适当介绍。
3. 【主要组成成份】
（1） 详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、内容物、比例或浓度、稳定性等信息，阴性/阳性对照品（或质控品）可能含有生物源性物质的组分，应说明其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
（2） 试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称、注册证号（如有）及其他必要的信息。
（3） 如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及该产品的医疗器械注册证号等详细信息。
4. 【储存条件及有效期】
试剂盒的效期（实时）稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等。
5. 【适用仪器】
所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
6. 【样本要求】
重点明确以下内容：
（1） 对适用的样本类型作详细介绍，包括样本来源及取材要求、样本处理方式（如组织样本的固定及包埋方式）、肿瘤细胞比例等。
样本的取材及处理方式等若有通用的技术规范或指南，则应遵循，并在此处引用。
（2） 样本处理及保存：核酸提取前样本的预处理、保存条件及期限（短期、长期）、运输条件等。
（3） 在提取过程结束后，立即采用适当方法（如分光光度计法）对提取后的核酸储备液进行浓度确定，并依据性能验证结果在此给出用于扩增试验的核酸浓度要求。举例：扩增反应终体系中需要50ng的DNA量，而在终体系中需加入25μl的DNA储备液，则在DNA提取完成后应将DNA储备液的浓度调整至2ng/μl的浓度。
注：基于试剂盒分析灵敏度的考虑，应对提取后的核酸储备液的核酸浓度设定低限要求，如提取后的核酸储备液浓度低于其低限要求，应扩大样本量重新进行核酸的提取。
（4） 操作过程中各种制备液的稳定性要求，如各类混合液（Mix）、DNA/RNA储备液、反应终体系等(常温/冷藏/冷冻/冻融次数限制等）。
7. 【检验方法】
详细说明实验操作的各个步骤，包括：
（1） 实验条件：实验室分区、实验环境的温度、湿度、空调气流方向控制等注意事项。
（2） 试剂配制方法、注意事项。
（3） 详述核酸提取的条件、步骤及注意事项。对照品（质控品）应参与样本核酸的平行提取，以对核酸提取环节进行合理的质量控制。
（4） 扩增反应前准备：各组分加样体积、顺序、相关注意事项等。
（5） 逆转录过程（如涉及）的温度和时间设置、PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置及相关注意事项。
（6） 仪器设置：特殊参数，待测基因、内标和外标的荧光通道选择等。
8. 【参考值（参考范围）】
参考值（参考范围）的描述包括基线的确定方法和循环阈值（Ct值）的要求。除Ct值要求外，建议结合是否出现典型S形曲线对结果进行判断。
9. 【检验结果的解释】
结合阳性对照、阴性对照以及样本管中靶基因和内标的检测结果（Ct值），对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。如存在检测灰区，应对灰区结果的处理方式一并详述。
10. 【检验方法的局限性】
（1） 本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者个性化治疗的选择应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
（2） 阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞过少、过度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。
（3） 不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。
（4） 明确该检测仅限于规定的样本类型及检测系统（包括适用机型、核酸提取试剂、检测方法等）。
11. 【产品性能指标】
详述以下性能指标：
（1） 对相应国家参考品（如有）检测的符合情况。
（2） 最低检测限（分析灵敏度）：试剂盒能够覆盖的所有突变靶序列的最低检出浓度，重点考虑原始模板中突变基因的百分率和扩增终体系中核酸浓度两个因素对分析灵敏度的影响。简单介绍最低检测限的确定方法以及对最低检测限验证所采用的靶序列的信息。
（3） 企业内部阳性/阴性参考品符合率，阳性/阴性参考品的组成、来源、浓度梯度设置以及评价标准等信息。
（4） 精密度：精密度参考品的组成、来源、浓度梯度要求及评价标准。
（5） 分析特异性
①野生型验证：应采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，其结果应均为阴性。
②试剂盒内交叉反应：如考核试剂包括对多个突变位点的检测，则应对该试剂盒覆盖范围内的所有突变类型间进行交叉反应验证。
③序列相近或具有一定同源性的其他较常见突变或野生型基因序列间的交叉反应验证。
④潜在干扰物质验证。
如果经验证发现某些序列与靶序列的交叉反应出现阳性结果，则应该对存在交叉反应的核酸序列及浓度进行验证并在产品说明书中表明这种假阳性发生的可能，做出相关的提示。
（6） 对比试验研究（如有）：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。
12. 【注意事项】
应至少包括以下内容：
（1） 如该产品含有人源或动物源性物质，应给出具有潜在感染性的警告。
（2） 临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。
(三)拟定产品标准及编制说明
拟定产品标准应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》的相关规定。另外，对于国产试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。附录中应将待测靶基因的基因位点、引物/探针设计及来源、参考品设置、来源及验证情况、各种酶的来源、特性及验证等重点内容予以明确。
肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂的注册检测应主要包括以下性能指标：物理性状、试剂盒内阴/阳性对照品（质控品）的Ct值要求（包括内标）、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限（分析灵敏度）等。阳性参考品主要考察对试剂盒覆盖范围内不同突变基因的检测符合性，阴性参考品则重点对申报试剂的分析特异性进行验证。
如果申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于国家/行业标准的要求。
(四)注册检测
根据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》的要求，首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续3个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家标准品的检测项目，在注册检测时应采用相应的国家标准品进行,对于目前尚无国家标准品的项目，生产企业应建立自己的参考品体系并提供相应的内部参考品。
(五)主要原材料研究资料
应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交工艺验证报告；如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。
1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
2. PCR和/或RT-PCR组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：
（1） 脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。
（2） 引物
由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化。需提供对分子量、纯度、稳定性、功能性实验等的验证资料。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。
（3） 探针
特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化，在5-端(和/或3-端)进行标记，并经HPLC或其他适宜方法纯化，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱，应对探针的分子量及标记的荧光素进行核实，并进行功能性试验验证。
（4） 酶
DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证；逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。
3. 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和RNase污染。
4. 企业内部参考品：应详细说明有关企业内部参考品的原料选择、制备、定值过程等试验资料。具体要求如下：
（1） 阳性参考品
试剂盒（分型或不分型）所能覆盖的所有突变位点均应设置相应的阳性参考品，每个突变位点设置至少三个突变百分率梯度，其中需包括至少一份弱阳性参考品。阳性参考品的突变形式及浓度需经过金标准方法或已上市同类分型试剂的确认。
如申报试剂用于DNA样本的检测，则阳性参考品可以采用临床样本提取的DNA储备液或相应质粒作为原料。如申报试剂用于RNA样本的检测，阳性参考品可以采用临床样本提取的RNA储备液、相应RNA冻干粉或假病毒的形式；如覆盖突变位点过多，可以对其中部分突变位点采用质粒的形式，但不能全部采用质粒，需包括部分突变类型（申请人自行确定其代表性）RNA为模板的阳性参考品以对逆转录（RT）过程进行监控。
（2） 阴性参考品
可采用源于健康人、经确认无相应靶突变序列的野生型DNA储存液。
（3） 灵敏度参考品（检测限参考品）
灵敏度参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有的突变类型，可以仅设置分析灵敏度水平的一个浓度即可。
（4） 精密度参考品
精密度参考品原料要求参考阳性参考品，需包括阴性、弱阳性、中或强阳性三个浓度水平的精密度验证，阴性和中/强阳性精密度参考品可不必包括所有突变类型，以常见突变类型（申请人自行确定其代表性）为主，但弱阳性参考品需包括所有突变位点。
5. 试剂盒内对照品（质控品）
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸提取、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。所有阳性对照品的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为DNA或RNA。申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。申请人应视申报产品具体情况设置合理的试剂盒对照品（质控品），试剂盒质控体系主要考虑以下几方面要求。
（1） 阳性对照品（质控品）
建议对每个样品反应管设置至少一份阳性对照品（质控品），阳性对照品应参与样本核酸的平行提取，以对样本提取、试剂及仪器性能、扩增反应过程等环节进行质量控制，企业应对各种阳性对照（质控）品的Ct值做出明确的范围要求。如样本反应管内可以覆盖多种突变序列的检测（分型或不分型），相应的阳性对照管可以不必涉及所有突变类型，但应选择较常见突变序列或理论上较难测得的突变序列作为阳性对照。
（2） 内对照（内标）
内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，尤其是靶核酸为RNA、用于基因重排或基因表达异常等检测目的时，可以采用管家基因或与靶基因浓度水平相当的其他基因序列作为相应的内对照（内标）。申请人应对内对照（内标）的引物、探针和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制而导致假阴性。
（3） 阴性对照
阴性对照对可能存在的交叉污染进行假阳性结果的质控。
(六)主要生产工艺及反应体系的研究资料
生产工艺及反应体系的研究资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置、Ct（临界）值确定等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。主要包括以下内容：
1. 主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。
2. 反应原理介绍。
3. 基因位点选择、(RT)-PCR方法学特性介绍。
4. 确定最佳(RT)-PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度等。
5. 确定逆转录过程（如涉及）的温度和时间的研究资料，PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
6. 对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。
7. 不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。
8. 如申报产品包含核酸提取试剂，应提交对核酸提取过程进行工艺优化的研究资料。
(七)分析性能评估资料
企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。建议着重对以下分析性能进行研究。如有相应的国家参考品，应在分析性能评估阶段采用国家参考品对产品性能进行验证。
1. 样本核酸提取
样本核酸的提取主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，样本核酸提取是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。尤其是石蜡包埋组织样本在福尔马林固定过程中，会使样品中的核酸与核酸之间，核酸与蛋白之间发生交联，并且样本在不当的保存条件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸提取的难度。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做充分的验证。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
2. 阳性/阴性参考品符合率
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应Ct值的限制；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性；如有野生型参考品的设置，在其相应的引物探针组合下检测应为阳性。
3. 最低检测限（分析灵敏度）
建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准，扩增反应终体系中的突变序列百分率和总核酸浓度两个因素对分析灵敏度的影响较大，终体系中突变序列的百分率越高、所含的DNA（RNA）量越多，则越容易检出。因此，试剂盒最低检测限主要考虑以下两种情形。
（1） 在扩增反应终体系特定核酸浓度下，突变序列所占百分率的最低检测限。
采用野生型临床样本和较高突变百分率的临床样本提取的核酸储备液进行混合，确定扩增反应终体系中的核酸浓度，采用合理的试验方法（如深测序）对混合后样本中突变序列所占百分率进行确认，并逐渐调整野生型和突变型核酸储备液的比例以得到含不同突变序列百分率的混合液，对各份混合液进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率水平，作为在固定的核酸浓度条件下，可以检测到的最低的突变序列百分率。
举例：在50ng/40ul水平，可以达到95%阳性检出率的最低突变序列百分率为10%。
（2） 在特定突变序列百分率下，反应终体系中核酸浓度的最低检测限。
采用合理的实验方法确定待测样本中的突变序列所占的百分率（如固定在10%的水平），再逐级稀释成不同核酸浓度样本，分别对各梯度浓度样本进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率的最低DNA（RNA）浓度。
举例：在10%的突变序列百分率水平，40ul扩增反应终体系中，DNA浓度的最低检测限为50ng/40ul。
（3） 评价肿瘤组织含量、DNA（RNA）降解等因素对分析灵敏度可能造成的影响。
4. 分析特异性
（1） 野生型验证：采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，结果应为阴性。
（2） 交叉反应，对于此类产品的交叉反应验证主要考虑以下几方面情形：
①申报试剂所覆盖的全部突变类型间的交叉反应；
②核酸序列具有同源性、易引起交叉反应的野生型或其它突变类型间的交叉反应。
申请人应提供所有用于交叉反应验证的突变或野生型序列、序列确认和浓度选择等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
（3） 干扰物质
①申请人应根据试剂盒所采用的样本类型，确定潜在的干扰物质。
②用于干扰试验的样本，靶基因浓度应至少包含弱阳性，而不应仅选择强阳性样本，使用医学相关水平的干扰物质进行验证。此外，建议申请人同时在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下同样进行评价。
有关干扰物质的研究结果亦应总结于产品说明书的【产品性能指标】项下。
5. 精密度
测量精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考国际或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
（1） 对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括提取组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。
（2） 合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
（3） 用于精密度评价的质控品应至少包括3个水平:
①阴性参考品：待测靶核酸浓度低于最低检测限或为零浓度，建议选用背景值较高的阴性样本，阴性符合率应为100%（n≥20）。
②弱阳性参考品：待测靶核酸浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应达到100%（n≥20）。注：弱阳性参考品需包括所有的突变位点，如果待测物靶核酸为RNA，则弱阳性精密度参考品中应至少部分典型突变位点的原料为RNA，如RNA干粉或相应的假病毒。
③高浓度参考品：待测靶核酸呈中到强阳性的浓度，阳性检出率为100%且CV≤15%（n≥20）。注：如果试剂盒可以覆盖多个突变位点的检测，该参考品可以设置为对全部突变位点进行精密度验证，也可以选择其中部分突变位点进行验证，但应至少包含常见突变序列或理论上较难测得的突变序列。
6. 其他需注意问题
对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。若试剂盒适用的样本类型不止一种，如既包含石蜡包埋组织切片亦包含冷冻组织切片或血液样本等，则需对所有样本类型的适用性进行评估，并提交评估资料。
(八)参考值（参考范围）确定资料
对于此类试剂，参考值确定资料主要是指Ct值的确认资料，建议申请人采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。
(九)稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
另外，样本稳定性的研究对于实验的成败也至关重要。特别是当使用标本类型包括组织标本时，肿瘤组织标本经过特殊处理后其核酸序列的完整性容易遭到破坏，因此应提供对样本保存条件、保存时间等方面的详细研究资料。样本稳定性研究主要包括核酸提取前样本稳定性和提取后核酸在储备液中的稳定性两方面。在合理的温度范围内选择多个温度点（应至少包括范围的上限和下限温度），每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
(十)临床试验研究
对于国内外尚无同类产品被批准上市的新的肿瘤相关基因突变，相关检测试剂进行临床研究时，申请人应将试剂盒临床研究纳入相关药物的临床研究或临床应用中，通过对特定的肿瘤病人进行治疗前后的跟踪随访，以临床对于患者个体化治疗方案及有效性的综合判断为金标准，评价此类试剂用于指导肿瘤个体化用药的临床性能。研究者应明确研究对象的入选标准、随访标准和随访时间。有关此类临床研究的方案设计和评价标准等应符合体外诊断试剂及药物临床研究相关法规要求。
对于已有同类产品上市的、基因突变与肿瘤个体化用药方案的相关性已经得到确认的产品，则申请人既可采用试剂盒检测与相关药物治疗相结合对特定的肿瘤病人进行治疗前后的跟踪临床研究的方法，亦可在充分结合相关的病例信息的情况下，采用考核试剂与参比方法进行对比试验的研究方法，对考核试剂的临床应用有效性进行评价。以下要求均针对采用对比试验方法的临床研究提出。
1. 参比方法的选择可以考虑以下几方面：
（1） 如已有同类产品上市，其临床研究可以选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。但应充分考虑已上市同类试剂的突变位点选择、靶序列选择、分析灵敏度等特性，确保考核试剂与申报试剂具有明确可比性。
（2） 申请人亦可采用核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的参比方法，验证考核试剂检测结果与核酸序列测定结果之间的一致性情况。临床研究报告中应对选用的测序方法做详细介绍，包括测序仪型号、相关引物设计、性能验证和测序方法的质量控制等资料，以及提供测序服务的机构介绍和选择依据等。
（3） 此外，在充分考虑检测结果具有明确可比性的前提下，也可以选择荧光原位杂交（FISH）或免疫组化等染色体或蛋白水平的检测技术作为参比方法，但考虑到检测结果之间不具有直接的可比性，建议对所有阳性病例采用其他分子生物学技术（如核酸序列测定）对结果予以确认。
2. 临床研究单位的选择
建议申请人在选择临床单位时，应在国内不同区域选择临床单位，尽量使各单位的临床样本有一定的区域代表性；临床研究单位应具有分子病理诊断和分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和参比方法都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
3. 临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的参比试剂应完全一致，以便进行合理的统计学分析。临床方案中还应明确确证试剂及方法。另外，考核试剂适用的样本类型、可检测的基因突变类型不应超越参比试剂的相应检测要求，若此种情况发生，则应选择其他合理方法对额外的样本类型和基因突变类型进行验证。
4. 病例选择及阳性病例比例
临床试验应以肿瘤患者为研究对象，其中试剂盒规定范围的每种突变类型均应有一定量的阳性病例。对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应的需要，以从临床角度考察其分析特异性。阴/阳性病例均应覆盖所有适用的肿瘤类型。若产品适用于多种样本类型，则应对所有样本类型均进行临床验证。
5. 统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、受试者工作特征（ROC）曲线分析、阴性/阳性符合率等。对于本类产品对比实验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表χ2检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果有无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
6. 结果差异样本的验证
在数据收集过程中，对于两种方法检测结果不一致的样本，应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。
7. 临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
（1） 临床试验总体设计及方案描述
①临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
②病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准。
③样本类型，样本的收集、处理及保存等。
④统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
（2） 具体的临床试验情况
①临床研究所用产品的名称、批号、有效期及所用机型等信息，以及对比试验产品的注册情况。
②对各研究单位的病例数、年龄分布情况进行综合分析，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
③质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、质控品运行情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
④具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。
（3） 统计学分析
①数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
②阳性符合率、阴性符合率、总体符合率。
③以交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表χ2检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。
另外考虑到对不同样本类型以及不同年龄段人群的检测结果可能存在一定差异，故建议对不同样本类型及不同年龄段人群分别进行统计分析，以对考核试剂的临床性能进行综合分析。
（4） 讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
四、 名词解释
1. 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR：
聚合酶链式反应或多聚酶链式反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。
2. 杂交 hybridization
具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）可以通过氢键的方式，按碱基互补配对原则相结合。
3. 荧光探针PCR
在PCR过程中利用荧光染料释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量进行分析的PCR。
4. 分析特异性 analytical specificity
测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述，并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度。
注：潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物。
5. 精密度 precision
在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。
6. 检测限 detection limit, limit of detection
样品中以一定概率可被声明与零有差异的被测测量的最低值。
7. 阈值循环数 cycle threshold, Ct
实时监测扩增过程中，反应管内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct）。
8. 突变 mutation
是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的可遗传的改变。
9. 内标 internal control
在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子，其目的是鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。
五、 参考文献
1. 《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》,（国食药监械〔2007〕229号）,2007年4月19日
2. 《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》,（国食药监械〔2007〕240号）,2007年4月28日
3. 《体外诊断试剂说明书编写指导原则》,（国食药监械〔2007〕240号）,2007年4月28日
4. Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection or Detection and Differentiation of Influenza Viruses. CDRH, FDA, USA, February 15, 2008
5. 彭文伟.传染病学,第五版.人民卫生出版社，2001
6. 李金明.实时荧光PCR技术,第一版.人民军医出版社, 2007
7. Robert F. Weaver. Molecular Biology, 4th Edition, 2008
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9. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS), MM3-A2, Vol26 No.8, ISBN 1-56238-596-8
10. Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline. NCCLS, MM6-A, Vol. 23 No.28. ISBN 1-56238-508-9
11. Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS), MM17-A, Vol.28 No.9, ISBN 1-56238-661-1
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14. T.斯特罗恩，A.P.里德 编著. 孙开来 主译. 人类分子遗传学,第三版. 北京：科学出版社,2007
乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技
乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂
注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脱氧核糖核酸(deoxyribose nucleic acid, DNA)定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）定量检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则不包含的研究内容，可自行补充。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个严重的公共卫生问题，我国属乙型肝炎感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因乙型肝炎导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例，新发乙型肝炎病例约50 万～100万例，乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。
乙型肝炎是血源传播性疾病，主要经血（如不安全注射等）、母婴及性接触传播。HBV属嗜肝脱氧核糖核酸（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因组长约3.2 kb，为部分双链环状DNA。急性HBV感染DNA存在先阳性后消失的发展过程，慢性HBV感染的自然史一般可分为4个期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低（非）复制期和再活动期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度较高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。非活动或低（非）复制期滴度较低（小于2000 IU/ml），部分再活动期患者表现为HBV DNA活动性复制，但并不是所有HBV感染者都经历以上四期。
HBV已发现有9个基因型（A～I），每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。我国已发现A、B、C、D基因型，中东部地区以B、C基因型占优势，其中北方地区（长江以北）主要为C2亚型；南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主，西部藏族居民中以C/D重组基因型为主；A型和B1亚型罕见。
HBV DNA定量检测试剂是指利用包括实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物学方法在内的核酸检测技术，以HBV基因序列为检测靶标，对人血清、血浆及其他人体样本中的HBV DNA进行体外定量检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，可作为乙型肝炎辅助诊断的指标之一，还可通过对血液中HBV DNA浓度的检测可用于HBV感染的辅助诊断、治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。
本指导原则适用于实时荧光PCR方法的HBV DNA定量检测试剂，其他类同用途的核酸定量检测方法可参照本指导原则，但应根据产品特性确定其中具体内容是否适用，如不适用，应另行选择符合自身方法学特性的技术要求或评价方法。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
本指导原则不适用于国家法定血源筛查用HBV DNA检测试剂。
三、基本要求
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。
说明书承载了产品预期用途、试验原理、试验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据。因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，境外产品的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明参考文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，下面对HBV DNA定量检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地制定产品说明书。
1.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：
（1）试剂盒用于定量检测人血清、血浆等样本中的HBV DNA，适用样本类型应依据申报产品的分析性能评估和临床研究情况进行确认。
（2）待测人群特征介绍：主要为接受抗病毒治疗的乙型肝炎患者。
（3）临床用途：主要通过对乙型肝炎患者血中HBV DNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。
如有其他用途（如隐匿性感染的辅助诊断）则应对产品适应症人群、预期用途另行说明，并提供与之相应的分析性能评估以及临床验证等资料。本指导原则内容仅针对治疗监测用途进行要求。
（4）应当说明该试剂检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。
（5）明确说明该检测试剂不得用于血源筛查。
2.【主要组成成分】
（1）说明试剂盒所包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，如定量标准品、阴/阳性质控品含有人源组分，应提供其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
（2） 试剂盒中不包含但该项检测必需的组分，说明书中应列出相关试剂/耗材的名称、注册证号（如有）及其他相关信息。
（3）如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的生产企业、产品名称、注册证号（如有）以及配套仪器等详细信息。
3.【储存条件及有效期】
说明试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等，应标明具体的储存条件及效期。
4.【样本要求】
（1）样本收集要求：结合临床需要并参照慢性乙型肝炎防治指南（现行版）推荐的采样要求。
（2）血液样本应当说明对采血管及抗凝剂的要求：明确样本类型、采血管和抗凝剂，其他样本应说明样本采集、处理及保存方式。
（3）样本处理、运送及保存：对血液样本离心条件的要求，核酸提取前的预处理、运送条件、保存条件及期限（短期、长期）等。冷藏/冷冻样本检测前是否需恢复至室温，冻融次数的要求。如有需要应对高于检测范围的样本稀释方法进行规定。
5.【适用机型】注明所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
6.【检验方法】详细说明试验操作的各个步骤，包括：
（1）试剂准备及配制方法、注意事项。
（2）详述待测样本、相关校准品及质控品核酸提取的条件、步骤及注意事项。
（3）核酸提取/纯化方法的详细介绍。
（4）扩增反应前准备：加样体积、顺序等。
（5）PCR各阶段的温度、时间设置、循环设置及相关注意事项。
（6）仪器设置：特殊参数、结合探针的荧光素标记情况对待测基因及内标的荧光通道选择。
（7）基线、循环阈值（Ct值）的选择方法。
（8）校准方法的描述。
（9）实验的有效性判断：试剂盒内阴/阳性质控品、内标的Ct值要求。
7.【检验结果的解释】
检验结果应用IU/ml表示，结合阴、阳性质控结果，对低于检出限未检出、低于定量限、检测范围内及高于检测范围的检测结果分别进行界定。
8．【检验方法的局限性】
（1）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
（2）不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。
（3）明确该试剂仅限于规定的样本类型及适用机型。
9.【产品性能指标】详述以下性能指标：
（1）对相应国家参考品的符合情况。
（2）最低检出限及定量限：说明试剂不同样本类型的最低检出浓度和最低定量浓度，简单介绍最低检出限/定量限的确定方法以及对最低检出限/定量限验证所采用的基因型。
（3）精密度：精密度参考品的组分、浓度及评价标准、评价结果。
（4）线性范围：确定线性范围的方法、浓度范围、相关系数等信息。
（5）对不同基因型的覆盖：验证该试剂对HBV不同基因型的检测效果。
（6）特异性：
①临床特异性：应采用一定数量的临床HBV DNA阴性样本进行验证。
②交叉反应：易产生交叉反应的其他病原体核酸的验证情况，建议以列表的方式表示经过交叉反应验证的病原体名称、型别、浓度等信息。
③干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如血红蛋白、甘油三酯、胆红素等，应注明可接受的最高限值。
④药物影响：常用抗病毒药物、干扰素等对检测结果的影响，如未进行相关研究也应提供相关警示说明。
（7）对比试验研究：简要介绍对比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。
10.【注意事项】应至少包括以下内容：
（1）有关人源组分（如有）的警告，如：试剂盒内校准品、质控品或其他可能含有人源物质的组分，虽已通过乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗体（抗-HCV）等项目的检测为阴性，但截至目前，没有任何一项检测可以确保绝对安全，故仍应将这些组分作为潜在传染源对待。
（2）临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明书要求进行操作。
拟定产品标准应符合国食药监械〔2007〕229号和国食药监械〔2007〕609号文件的相关规定。另外，对于国产试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。附录中应将待测靶基因区域，引物/探针来源及验证情况，各种酶的来源、特性以验证情况等信息的重点内容予以明确。
HBV DNA定量检测试剂的注册检测应符合相应国家参考品检测要求。产品的性能指标应与说明书内容相符。
如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。
根据国食药监械〔2007〕229号要求，首次申请注册的第三类产品应在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家参考品的HBV DNA项目，在注册检测时应采用相应的国家参考品进行。
应提供主要原材料如引物、探针、酶、标准品或企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须稳定；如主要原材料源于外购，应提供的资料包括：供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。
1.企业内部参考品的制备、定值过程。建议采用灭活病毒的血清/血浆建立参考品，不宜使用质粒。
2.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
3.聚合酶链反应（PCR）组分的主要材料（包括引物、探针、内标、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：
（1） 脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验证资料。
（2）引物
由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，并对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等的验证。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。
（3） 探针
特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经PAEG或其他适宜方法纯化，在5'-端(和/或3'-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化,纯度应达到高效液相色谱纯。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。
（4） PCR反应所需酶
DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证；应提供有关保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料。
4.内对照（内标）、校准品及质控品的原料选择、制备、定值过程及试验资料。内标设置应合理，质控品宜采用混合阴性人血浆或血清作为基质。
5.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（Dnase）和核糖核酸酶（Rnase）污染。
基本生产工艺主要包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。
生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：
1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。
2.反应原理介绍。
3.基因位点选择、PCR方法学特性介绍。
4. DNA提取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、校准品、质控品均应全程参与提取纯化，不建议采用煮沸法进行DNA提取。
5.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。样本量应不少于200微升，加样量和反应体积参考相应行业标准，经研究验证后确定。
6.确定PCR各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
7.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。
8.不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别详述。
另外，对于试剂盒的内标、校准品、质控品设置，建议企业参考以下要求执行：
（1）样本反应管应设置合理的内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线，但又不能对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性，对内标的Ct应有明确的范围要求。
（2）HBV DNA定量检测试剂的质控品应至少设置三个量级水平的系列质控品:临界阳性质控品、强阳性质控品和阴性质控品。校准品和质控品均应参与样本核酸的平行提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各种质控品的Ct做出明确的范围要求。
（七）分析性能评估资料
申请人应提交生产者在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。分析性能评价的实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）文件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原则进行。对于HBV DNA定量检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。
1. HBV DNA提取
病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是决定PCR成败的关键环节。因此，无论申报产品是否含有DNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于DNA提取试剂的选择，除最大量分离出目的DNA外，还应有纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。目前常见的DNA分离纯化方法和改良方法各有优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择DNA分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料（提取效率、与后续试验的配合等）。
2.最低检出限与定量限（分析灵敏度）
（1）最低检出限与定量限的确定
建议使用国际参考品/国家参考品进行梯度稀释并多次检测，将具有95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检出限。建议最低检出限应不高于30IU/ml。
定量限应高于或等于检出限，将多次（至少10次）测量的结果符合试剂准确度要求的最低病毒水平作为定量限。
（2）最低检出限和定量限的验证
申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限的病毒浓度对不同基因型（至少包括B、C、D型）进行验证，总测试数不少于60次。定量限的验证应对不同基因型（至少包括B、C、D型）进行验证，总测试数不少于40次。
企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的各个病毒株的来源、型别确认及滴度确认试验等信息。
3.线性范围
线性范围确定的研究应使用高值临床样本（由可溯源至国家参考品/国际参考品的方法定量）进行梯度稀释，稀释液应使用经确认为阴性的混合人血清或血浆，应包含不少于9个浓度（应包含接近最低检测限的临界值浓度），使用至少3个批次的试剂进行试验。通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该产品的线性范围。
4.准确度
对测量准确度的评价依次包括：与国家参考品（和/或国际参考品）的比对研究、回收实验、方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。
（1）国家/国际参考品验证
此类检测试剂有相应的国家/国际参考品，应使用国家/国际参考品对试剂进行验证，重点观察对相应参考品检测结果的符合情况。
（2）回收试验。用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力，结果用回收率表示。通常对样本进行3～5次回收试验，取平均值即平均回收率。
回收试验注意事项：
①加入的标准液体积一般应小于样本体积的10%；
②尽量使加入标准液后样本中的被测物浓度接近医学决定水平；
③标准物的浓度应该足够高，以得到不同浓度的回收样本；
④注意基质效应，尽量采用与临床待测样本一致的基质
（3）方法学比对
采用参考方法或国内/国际普遍认为质量较好的同类试剂作为对比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的相关性了解拟申报试剂与参比方法间的一致情况。如显著相关，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与对比方法相比不会产生显著差异结果。
在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和对比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。
5.精密度
测量精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性，具体实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求：
（1）对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括提取组分和聚合酶链反应组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。
（2）合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
（3）用于精密度评价的质控品应至少包括四个水平:
①阴性质控品：不含乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）的质控品，不得检出阳性（n≥20）。
②临界阳性质控品：待测物浓度略高于试剂盒的最低检出限，阳性检出率应高于95%（n≥20）。
③弱阳性质控品：待测物浓度呈弱阳性（高于定量限浓度1个数量级），阳性检出率为100%且变异系数（CV）符合标准要求（n≥20）。
④强阳性质控品：待测物浓度呈中度至强阳性，阳性检出率为100%且CV符合标准要求（n≥20）。
6.HBV不同基因型的覆盖
应对乙肝病毒不同基因型（至少包括B、C、D型）进行检测，重点考察各基因型病毒样本的分析灵敏度、准确性及精密度指标，每个基因型的病毒样本稀释成至少3个浓度水平，对每水平样本进行重复测定。
7.特异性
（1）交叉反应
①用于HBV DNA检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状（推荐种类见表1）。
②建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为106 cfu/ml或更高，病毒为105 pfu/ml或更高。
③申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
表1 用于交叉反应研究的微生物（推荐）
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微生物 |
|
人巨细胞病毒 |
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E-B病毒 |
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人类免疫缺陷病毒 |
|
丙型肝炎病毒 |
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甲型肝炎病毒 |
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梅毒 |
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人类疱疹病毒6型 |
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单纯疱疹病毒1型 |
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单纯疱疹病毒2型 |
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甲型流感病毒 |
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痤疮丙酸杆菌 |
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金黄色葡萄球菌 |
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白色念珠菌 |
（2）干扰物质
①潜在的干扰物质主要包括：内源性物质（见表2）和常用的治疗药物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干扰素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韦（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。
②使用医学相关水平的干扰物浓度进行验证，另外，亦建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(最差条件)条件下进行评价。对于常见药物干扰试验，建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证。
③建议在病毒的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行检测。
表2 建议用于干扰研究的物质（推荐）
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物质 |
|
人白蛋白 |
|
胆红素* |
|
游离血红蛋白* |
|
甘油三酯* |
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系统性红斑狼疮患者血 |
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抗核抗体 |
|
类风湿因子 |
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总G型免疫球蛋白（IgG）* |
*为必须验证的干扰物质。
8.溯源性
应提交详细的溯源性研究资料。企业制备的企业内部参考品、二级参考品、用于制备商品化校准品的储备液以及不同基因型的阳性样本均应能够溯源至国家参考品/国际参考品。使用国家参考品/国际参考品为校准品，应用多台仪器对企业一级参考品进行校准，以下逐级对企业二级参考品、校准储备液、阳性参考品进行校准。
9.其他需注意问题
对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。如适用于不同样本类型，应提交对不同样本类型一致性的验证，包括不同抗凝剂、采血管的验证。
对于此类试剂，正常人群中不应检出HBV DNA，参考值确定资料主要是指Ct的确认资料，建议申请人采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
应对样本稳定性进行研究，主要包括室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
1.研究方法
对于该类试剂已有同类产品上市，按照法规要求选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。
建议预实验选择两种对比试剂同时进行验证，考察其误差范围，选择其中一种作为正式试验的对比试剂，另一种可作为第三方试剂。对比试剂的适用样本类型及检测范围应能够涵盖考核试剂的样本及检测性能要求，以免造成考核试剂部分性能无法验证的情况。
对比试验结果不一致（检测值差异较大）的样本应采用公认较好的第三方试剂进行验证。
2.临床研究单位的选择
建议申请人在选择临床研究单位时，应考虑到各试验单位之间的平行性和一定的地域代表性，临床研究单位应具有分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
3.临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的对比试剂应一致，以便进行合理的统计学分析，同时方案中应明确写明对于对比试验研究中测定结果不符的样本进行确认试验的第三方试剂或方法。
4.病例选择及样本类型
临床试验应样本数需不少于500例，其中应主要选择乙型肝炎患者样本（阳性样本），不少于450例。在病例选择时应考虑到地域性的差别，应涵盖不少于10例D基因型，应注重不同药物治疗的乙型肝炎患者。阳性样本应覆盖试剂线性范围，均匀分布高、中、低值。建议选择不少于50例的阴性样本进行比对试验，阴性样本主要考虑可能存在的交叉反应情况，应选择其他类肝炎病毒感染、其他良性或恶性肝脏疾病患者，以从临床角度考察其特异性。
临床试验中所涉及的样本类型应为实际临床检测中常用的样本类型。对于同时能够检测血清和血浆样本的试剂，应对至少50例同一乙型肝炎患者分别采集的血清和血浆样本进行比对试验研究，阳性样本应包括强、中、弱阳性及部分阴性样本。
临床研究应以新鲜样本为主，如采用库存样本应另行说明 。
5.统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，对于本类产品对比实验的等效性研究，常用相关性、线性回归对log10滴度结果进行统计分析，考察两组数据之间是否存在相关性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与对比试剂是否等效的标准。选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验，对检验结果进行符合率分析，计算阳性符合率、阴性符合率和总符合率。
6.结果差异样本的验证
在数据收集过程中，对于两种试剂的检测结果有不一致（检测结果差异较大）的样本，应采用临床上公认较好的第三种同类试剂进行确认试验，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。
7.临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
（1）临床试验总体设计及方案描述
① 临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
② 病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准。
③ 样本类型，样本的收集、处理及保存等。
④ 统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
（2） 具体的临床试验情况
① 申报试剂和对比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息。
② 对各研究单位的病例数、年龄分布情况、不同基因型分布情况进行总合，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
③ 质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
④ 具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。
（3） 统计学分析
① 数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
② 两组数据结果的相关性、线性回归的结果。
③ 对相关性及线性方程的显著性检验，验证两种试剂定量结果的一致性。
④阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%（或99%）的置信区间。
⑤以交叉表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验。
另外考虑到对不同样本类型的检测结果可能存在一定差异，故建议对不同样本类型分别进行统计分析，以对考核试剂的临床性能进行综合分析。
（4） 讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
四、名词解释
精密度（precision）：在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。
五、参考文献
1.《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》，（国食药监械〔2007〕229号），2007年4月19日。
2.《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》，（国食药监械〔2007〕240号），2007年4月28日。
3.《体外诊断试剂说明书编写指导原则》，（国食药监械〔2007〕240号），2007年4月28日。
4.李金明，《实时荧光PCR技术》，第一版，人民军医出版社，2007。
5.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社。
6.庄辉 ，乙型肝炎流行病学研究进展，中国医学前沿杂志2009年第1卷第2期。
7.中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会，慢性乙型肝炎防治指南（2010年版），《中国医学前沿杂志（电子版）》2011 年 第 3 卷 第 1 期。
8.黄留玉，《PCR最新技术原理、方法及应用》，化学工业出版社。
9.樊绮诗，吕建新，《分子生物学检验技术》，人民卫生出版社。
10.封波，慢性乙型肝炎抗病毒治疗研究进展-来自2010年美国肝病学会年会的报告，《中国医学前沿杂志（电子版）》2011年第3卷第1期。
11.Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens. CDRH, FDA, USA December 8, 2005。
人类免疫缺陷病毒检测试剂临床研究注册技术审
人类免疫缺陷病毒检测试剂临床研究
注册技术审查指导原则
一、前言
人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）检测试剂是指利用免疫学及分子生物学等方法原理对人血清、血浆或其他体液中的特定的HIV生物学标记物，包括HIV 1型（HIV-1 ）p24抗原、HIV抗体、HIV核酸、HIV基因耐药突变等进行定量或定性分析的试剂。据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）的分类原则，该类产品作为第三类体外诊断试剂（In Vitro Diagnostic,IVD）管理，属高风险管理产品。本指导原则制定的主要目的是让申请人明确在注册申报过程中对本类试剂在临床研究方面重点关注内容，同时规范注册申请人对于注册申报资料中有关临床研究资料的要求。
本指导原则是对HIV检测试剂临床研究的一般性要求，申请人应依据具体产品的特性对临床研究资料的内容进行充实和细化。申请人还应依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需具体阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则只是针对HIV检测试剂的特点，强调需重点考虑的问题，临床试验的基本要求应符合《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的规定，包括临床试验协议、方案、报告的撰写等。
本指导原则不包括行政审批要求，不作为法规强制执行。本指导原则是申请人和技术审评人员的指导文件，如果有能够满足适合的法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围
HIV生物学标记物是指机体在感染HIV后，在不同的感染阶段出现的生物学标记物，包括：HIV抗体、HIV-1p24抗原、HIV核酸、HIV基因耐药突变等。
就方法学而言，本指导原则主要适用于利用免疫印迹法、化学发光法、时间分辨免疫荧光法和微粒子酶联免疫法、胶体金法等免疫学方法对HIV抗原和/或抗体进行定量或定性检测的体外诊断试剂，以及应用核酸检测的方法（如实时荧光聚合酶链反应等）对HIV 核酸（核糖核酸/脱氧核糖核酸）以及基因耐药突变等进行检测和分析的体外诊断试剂，适用于首次注册产品及申请许可事项变更的产品。
（一）临床试验方案及方案中应关注的问题
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。各临床研究单位选用的对比试剂（包括与试剂配套的相应仪器）应完全一致，以便进行合理的统计学分析。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。临床试验中所涉及的样本类型应与产品说明书一致，且每种样本类型例数的选择应符合基本的统计学要求。
1.临床研究单位的选择
建议在选择临床单位时，综合不同地区人种、流行病学背景、HIV的特性等因素选择研究单位,临床研究单位的实验操作人员应熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉临床研究方案。
在整个实验中，拟申报产品（以下称考核试剂）、对比试剂、确认试验方法都应处于有效的质量控制下，同时按照试剂说明书的要求，定期对试验所涉及的仪器进行校准，以最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
建议在不同的临床单位使用同一批号考核试剂进行临床试验，以便对数据进行科学客观的统计分析。
2.新HIV检测试剂的临床研究
新HIV检测试剂（针对新标志物的检测试剂）主要包括两类：定量检测试剂和定性检测试剂。
对于这些无对比试剂可选择的新HIV检测试剂而言，其临床研究应选择经金标准方法确诊的HIV感染人群和部分未感染HIV的正常人群，并与已有的相关标记物和临床进展及转归进行比较研究，验证考核试剂的敏感性和特异性。
对于定量检测试剂同时还应对其量值与临床进展状况、转归、治疗情况等的相关性进行分析。
3.已有同类产品上市的临床研究
选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，使考核试剂与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。在临床研究中，与已有同类产品进行比对时，往往会出现不一致的检测结果。对于这些检测结果不一致的样本，应采用金标准或其他方法再次进行确认或提供临床诊断资料以进一步明确样本（采集样本时受试者）所处的感染状态，从而对考核试剂的性能进行客观科学的评价。
对于定量检测试剂，同时还应该分析检测量值的线性相关性、定量检测结果与对比试剂检测结果的一致性等。
4.临床研究对象选择
（1）总体要求
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求， HIV检测试剂，一般包括抗原和/或抗体（检测）类试剂、核酸扩增（检测）类试剂，二者对于临床研究的病例数并不相同。对于临床试验而言，抗原和/或抗体（检测）类试剂需要至少1000例，核酸扩增（检测）类试剂至少500例。
（2）基因型方面的考虑
HIV病毒为逆转录病毒，其基因具有显著的多样性，不同的地区和民族， HIV流行的基因型不同。境内流行的HIV主要为M组HIV-1（目前境内尚未见N组和O组HIV-1的报道，HIV-2感染病例的报道极少），其基因型主要为B/B’、BC重组型（包括CRF 07_BC重组型和CRF 08_BC重组型）以及AE重组型（CRF 01_AE重组型）。而且， HIV-1基因型具有一定的地域差异，不同地区流行的HIV基因型也不尽相同。因此，在选择HIV感染者病例时，首先应根据HIV流行的情况，选择能代表我国不同地区流行基因型的HIV-1感染者病例，以对试剂检测我国流行的HIV-1病毒的能力进行客观科学的评价，选择的基因型应至少包括上述三种主要的基因型。
①对于HIV-1感染者的病例数， HIV-1感染者病例数应具有统计学意义。
表1 不同HIV检测试剂对于临床样本选择的一些基本考虑
|
方法 |
例数 |
阳性样本 |
干扰 |
|
第三代发光类试剂
|
至少1000 |
HIV-1 400例 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于10例。 经过全面验证的阳转血清至少5套。 |
类风湿因子（RF+）,HIV相关病毒，孕妇样本等。 |
|
第四代发光类试剂
|
至少1000 |
HIV-1 400例 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于10例。 经过全面验证的阳转血清盘至少10套。 至少10份单独抗原阳性样本。 |
类风湿因子（RF+）, HIV相关病毒，孕妇样本等。 |
|
核酸检测(NAT)（定量） |
至少500 |
HIV-1 450例 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于30例，应具有统计学意义。 |
抗病毒治疗药物、HIV相关病毒。 |
|
核酸检测(NAT)（定性） |
至少500 |
HIV-1 300例 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于30例，应具有统计学意义。 |
抗病毒治疗药物、HIV相关病毒。 |
|
免疫印记 （WB） |
至少1000 |
HIV抗体初筛阳性600例，其中确诊病例不少于80%。 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于10例。 |
类风湿因子（RF+）, 相关病毒。 |
|
胶体金类 |
至少1000 |
HIV-1 400例 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于10例。
|
类风湿因子（RF+）, 相关病毒，孕妇样本等。 |
|
基因耐药突变 |
至少500 |
HIV-1 450例 对于我国流行的主要基因型（至少3种）每种不少于30例，应具有统计学意义。 蛋白酶基因区存在典型的耐药突变的样本至少100例。 逆转录酶基因区存在典型的耐药突变的样本至少300例。 |
抗病毒治疗药物、相关病毒。 |
注：阳转血清盘检测结果的评价，应参考国内、国际的相关规定或文献进行评价。
②对于HIV-1 O组、HIV-2感染病例，也应进行适当验证，样本应经过科学的验证和确认，考虑到此类样本的不易获得性，样本可来源于HIV感染者，也可来源于经过科学验证的血清盘。
（3）不同感染阶段的考虑
HIV感染机体后，在不同的时期机体的免疫反应不同，其代表的生物学标记物、标记物的浓度也不同，样本选择时，对于样本滴度应含有一定数量的低滴度/弱阳性样本。
（4）临床样本量的考虑
临床研究应选择部分正常健康人群样本和干扰样本（交叉反应样本），比较正常组、干扰组和感染组结果，以便对申报产品的临床性能做出科学的分析。建议对抗原和抗体类试剂，其健康人群例数的选择以不超过500例为宜，阳性样本数应符合表1要求，其余为干扰样本。对核酸检测类试剂（定性），其健康人群例数的选择以不超过150例为宜，阳性样本数应符合表1要求，其余为干扰样本。对核酸检测类试剂（定量），其健康人群例数的选择以不超过30例为宜，阳性样本数应符合表1要求，其余为干扰样本。对于新型试剂或临床意义有待进一步明确的试剂，可适当增加正常样本数。总体而言，本类试剂临床试验的样本例数，无论是正常组、干扰组和HIV感染组，每一组受试者的最小入选人数须满足统计学分析的基本要求。
检测的样本量在每一个临床研究单位应尽可能均匀分布，包括正常组、干扰组和HIV感染组。
（5）干扰（交叉反应）样本的考虑
考虑到我国HIV感染的特殊情况以及HIV的传播特点，建议在临床研究中选择临床病例时，应选择部分HIV相关病毒（如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）感染的病例，以评价考核试剂的特异性。（样本种类见表2）
表2 用于干扰（交叉反应）研究的样本
|
Ⅰ/Ⅱ型人类嗜T细胞病毒（HTLV-Ⅰ/Ⅱ） |
巨细胞病毒（CMV） |
|
甲型流感病毒 |
EB病毒（EBV） |
|
甲型肝炎病毒（HAV） |
系统性红斑狼疮（SLE） |
|
乙型肝炎病毒（HBV） |
类风湿因子（RF） |
|
丙型肝炎病毒（HCV） |
抗核抗体（ANA） |
以上特异性样本可根据产品特性进行适当选择。
5.体液样本的考虑
对于口腔粘膜渗出液、尿液等体液样本，无论考核试剂采用何种检验方法，均应采用来自同一患者的血液样本进行同源对比试验，应含有一定数量的低滴度/弱阳性样本（不少于20例）。
检测血液样本用对比试剂的检测性能应尽量高于考核试剂，对于对比试验研究中测定结果不符的样本应采用金标准方法对血液样本进行确认试验。
6.冻存与新鲜样本的考虑
阳性冻存样本例数应小于阳性样本总例数的90％，阳性新鲜样本例数应大于阳性样本总例数的10％。
7.抗体确认试剂的考虑
①样本的选择：见表1初筛呈阳性。
②对比试剂的选择：应选择确认试剂进行比对试验。
③不一致和不确定样本的确认：应进行患者随访检测（4周后）或采用其他方法进行验证。
8.统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法。
对于定性试剂，应分析考核试剂的阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%（或99%）的置信区间、考核试剂和对比试剂的一致性（如kappa值）。如利用阳转血清盘对试剂检测早期感染的能力进行评价，可参考世界卫生组织（WHO）对HIV抗体试剂（和/或HIV抗原抗体试剂）的评价报告，分析考核试剂的阳转血清相对敏感性系数，或采用其他适宜的方法进行分析评价，并提供详细的评价方案、评价方案的依据、统计方法等具体信息。
对定量试剂，应分析考核试剂阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%（或99%）的置信区间、考核试剂和对比试剂的一致性（如kappa值）等之外，还应该分析考核试剂与对比试剂的相关性、线性回归、定量准确性及一致性（如Bland-Altman 模型），同时按基因型（核酸检测试剂）对样本进行分组分析考核试剂与对比试剂的相关性、线性回归、定量准确性及一致性（如Bland-Altman 模型）等。
对于对比实验的等效性研究，可采用考核试剂和对比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（r值）、回归方程斜率及y轴截距等指标。
对于统计方法的选择可以考虑多种方法，而不用过于强调一种方法。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与对比试剂是否等效的标准。
9.结果差异样本的验证
在数据收集过程中，对于两种试剂的检测结果有明显差异的样本，应采用金标准或其他方法再次进行确认（如HIV-1 p24抗原、HIV-1核糖核酸检测试剂、蛋白质印记试剂等），对患者所处的HIV-1感染状态进行鉴别，同时结合患者的临床表征对差异原因及可能结果进行分析，必要时应按照《全国艾滋病检测技术规范》(2009)的要求进行随访。
（二）临床试验（总结）报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床试验总结报告中对以下内容进行详述。
1.临床试验总体设计及方案描述
（1）临床试验的整体管理情况、临床研究单位的选择、对比试剂及所用仪器基本情况介绍。
（2）病例纳入/排除标准、不同病种的预期选择例数。
（3）样本类型，样本的收集、处理及保存等。
（4）统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
2.具体的临床试验情况
（1）对各研究单位的病例数、病种分布情况进行总合，以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
（2）质量控制：如试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况等。
（3）具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的验证鉴别等。
3.统计学分析
（1）数据预处理、差异数据的重新检测或验证鉴别以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改等。
（2）一致性分析和相关性
相关性主要包括阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%（或99%）的置信区间。一般可采用四格表卡方检验或kappa检验对两种试剂定性检测结果的一致性进行分析。
对于定量试剂，应选用特定的数据分析模型（如Bland-Altman 模型）对两种试剂定量分析结果的一致性进行分析。同时，还应采用回归分析的方法分析两种试剂检测结果的相关性，以y=a+bx和R2的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是对比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R2是判定系数，并给出a和b的95%（或99%）置信区间。由于对不同的HIV-1基因型或者不同浓度区间样本，试剂的性能可能存在一定差异，因此，建议对总体样本，按照浓度范围和/或基因型进行区间分层统计，对不同区间内的结果进行相关性和一致性分析，以更好地验证两种试剂的相关性。
4.讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后给出临床试验结论。
四、参考文献
1.《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》，（国食药监械〔2007〕229号），2007年4月19日。
2.《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》，（国食药监械〔2007〕240号），2007年4月28日。
3.《全国艾滋病检测技术规范》（2009）。
病原体特异性M型免疫球蛋白定性检测试剂注册技
病原体特异性M型免疫球蛋白定性检测试剂
一、前言
本指导原则旨在指导注册申请人对病原体特异性M型免疫球蛋白（Immunoglobulin M，IgM）定性检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对病原体特异性IgM抗体定性检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
病原体特异性IgM抗体定性检测试剂是指利用酶联免疫吸附法、化学发光法或磁微粒酶免疫技术等基于抗原抗体反应原理，以特定病原体的特异性IgM抗体为检测目标，对人血清或血浆样本中病原体特异性IgM抗体进行体外定性检测的试剂。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
根据结构不同，人免疫球蛋白可分为G型免疫球蛋白（IgG）、M型免疫球蛋白（IgM）、A型免疫球蛋白（IgA）、E型免疫球蛋白（IgE）和D型免疫球蛋白（IgD）5种类型， IgM占血清免疫球蛋白总量的5%～10%。分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的免疫球蛋白分子，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。五聚体IgM含10个抗原结合片段（Fab段），有很强的抗原结合能力，含5个可结晶化片段（Fc段），比G型免疫球蛋白（IgG）更易激活补体，IgM抗体一般为保护性抗体，具有免疫性。IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM，且由于IgM分子量大，不能通过母血进入胎儿体内，故脐带血或新生儿血液中特异性IgM升高常提示胎儿或新生儿存在宫内或围生期感染。在病原体感染的初次体液免疫应答中(原发性感染)，特异性IgM抗体首先出现，但其普遍反应短暂，一般几周后即不易再测到。病原体特异性IgM抗体阳性常提示早期感染，可用于感染急性期的辅助判断。人血液样本中病原体特异性IgM抗体的定性检测，对某些传染病如甲型肝炎、乙型肝炎、TORCH（弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒）类病原体感染等有较高的临床参考价值。不具备病原体分离培养鉴定实验室的临床检测机构常将病原体特异性IgM抗体的检测作为早期感染的唯一依据，因此，病原体特异性IgM抗体检测结果的准确性显得颇为重要。假阳性结果可能导致病人接受不必要的抗病原体治疗而假阴性结果则有可能造成患者治疗的延误，由特异性IgM抗体检测造成的误诊或漏诊对孕妇或胎儿可能造成很大伤害。相关生产企业必须充分意识到该类产品的潜在风险，根据本指导原则的要求对该类试剂的安全性和有效性进行科学合理的验证。
综述资料主要包括产品临床适用症背景情况、预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及临床适用范围等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。综述资料注册申报资料的重要组分之一，其内容应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。另外，建议申请人对以下几方面内容进行着重介绍：
1．特定病原体的生物学特性、结构与功能、感染过程、潜伏期、特异性IgM抗体产生及可持续存在时间、病理背景等。
2．特定病原体感染相关的疾病情况、流行病学以及易患（高危）人群的说明。
3．对申报试剂检测结果可能带来的风险进行合理评估，即由申报试剂的假阳性/假阴性结果导致的对患者临床诊治、孕妇或胎儿的不恰当处理、疫苗接种、流行病学等方面的负面影响。
4．用于特定病原体特异性IgM抗体检测方法的发展历程摘要及各种检测方法的优缺点评价。
说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独注明文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，下面对病原体特异性IgM抗体定性检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。
1.【预期用途】 应至少包括以下几部分内容：
（1）试剂盒用于体外定性检测人血清和/或血浆样本中xx的特异性IgM抗体。
（2）简单介绍待测目标的特征，如特定病原体的生物学性状、潜伏期、易感人群、感染后的临床表现等临床背景相关的信息介绍；适用于对哪些患者人群的检测，如具有何种症状/体征的患者、相关的密切接触者、地域要求或年龄限制（如有）等。
（3）病原体特异性IgM抗体的产生、持续时间、与特异性IgG、病原体核酸等其他检测指标的关联；
（4）该试剂盒的应用是否需要配套使用的专用仪器，与靶抗体检测相关的其他检测技术的介绍。
2.【主要组成成分】
（1）说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，阴性/阳性对照品可能含有人源组分，应提供其生物学来源、灭活方法及无传染性确认的方法等。
（2）对检测中使用的抗原及抗体的信息进行简单介绍。
（3）试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。
3.【储存条件及有效期】
对试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、运输稳定性等信息做详细介绍。
胶体金试纸条产品应对开封后未使用产品允许暴露于空气中的温度、湿度及期限等条件予以明确。
4.【样本要求】 重点明确以下内容：
（1）样本采集前对患者的要求：如采集时间、采集顺序等，是否受临床症状、用药情况等因素的影响。
（2）样本采集：说明采集方法及样本类型，如有血浆样本，应注明对抗凝剂的要求。
（3）样本处理及保存：样本处理方法、保存条件及期限（短期、长期）、运输条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复室温，冻融次数。经热处理样本是否可用、对储存样本的添加剂要求等。
（4）如果检测系统含有某种IgG抗体的去除技术（IgG吸附剂），如抗人IgG抗体等，则应包括IgG吸附剂使用相关的注意事项。例如：经IgG吸附剂处理的样本不能用于 IgG类抗体的检测；在检测IgM类抗体的同时，检测处理过的混合物中的IgG类抗体，以证实对IgG、类风湿因子（RF）等去除的有效性等。
5.【检验方法】 详细说明试验操作的各个步骤：
（1）实验环境：温、湿度条件，检测试剂及样本的复温要求及相关注意事项。例如：冻存样本在复融后应经过充分的混匀再行检测。
（2）试剂配制方法、注意事项，试剂开封后使用方法及注意事项等。
（3）试验条件：操作步骤、温度、时间、仪器波长等以及试验过程中的注意事项。不同型号产品，加样方法如有差异，建议分别以图示方式描述清楚。
6.【检验结果的解释】
结果判断或计算：详细描述对检测结果的判定或计算方法、对质控品（对照品）的检测结果要求（试验有效性的判断）等。如果质控品和病人样本的使用方法不同，生产商应注明必要的指导和解释。建议在质控品（对照品）结果解释环节注明以下字样：“如果质控结果与预期不符，实验室不应出具检测报告。”
7.【检验方法局限性】
综合产品的预期用途、临床背景、检测方法及适用范围等信息，对可能出现的局限性进行相关说明，主要包括以下描述，请申请人选择适用的条款在产品说明书中予以阐述。
（1）本产品检测结果仅供临床参考，不应作为临床诊治的唯一依据，对患者的临床管理应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查（尤其是病原学检测）、治疗反应及流行病学等信息综合考虑。
（2）感染初期，病原体特异性IgM抗体未产生或滴度很低会导致阴性结果，如怀疑有病原体感染，应提示患者在7－14天内复查，抽取第二份样本，并和第一份样本在同条件下同时检测，以确定是否有初次感染的血清转化或病原体特异IgM或IgG抗体滴度明显升高。
（3）高滴度病原体特异性IgG抗体会与特异性IgM抗体竞争抗原结合部位，会使检测的敏感性降低，IgM结果可能会出现假性低值或阴性结果。尤其是怀疑先天性病原体感染的新生儿样本，他们的血清中可能含有母亲来源的高水平病原体特异的IgG抗体和胎儿产生的相对低水平的病原体特异IgM抗体，因此，对于该类样本的阴性结果应慎重分析。
（4）由于脐带血中可能含有源于母体的病原体特异性IgM抗体（胎盘渗漏），因此，最好在出生后5天内再对婴儿的后续样本进行检测，以证实脐带血样本病原体特异性IgM抗体的阳性结果。建议将新生儿与母亲的血清样本平行进行测试，如果是胎儿的先天性感染,其IgM抗体水平(以及IgG抗体水平) 会持续存在或呈上升趋势, 反之,如果抗体来源于母体，则在在平行实验中婴儿的抗体水平会逐渐下降或消失。
（5）由于孕妇的实验室检查不能可靠地鉴定胎儿患病的风险，故不建议采用本试剂对无症状的母体感染进行筛查，不得将本试剂的检测结果单独作为终止妊娠的依据。
（6）免疫功能受损或接受免疫抑制治疗的患者，如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者或器官移植后接受免疫抑制治疗的患者，其血清学IgM抗体检测的参考价值有限，可能会导致错误的医学解释。
（7）在近几个月内接受过输血或其他血液制品治疗的人群，对其阳性检测结果的分析应慎重。
（8）病原体特异性IgM抗体不仅出现于初次感染，当二次感染和复发感染时也可能出现。
（9）当疾病的流行程度降低时阳性预测值降低，对低危人群阳性结果的解释应当谨慎。建议对申报试剂临床研究中的病例人群特征进行说明，并对适用人群的性别、年龄、地域等特征进行明示。
8.【产品性能指标】 详述以下性能指标：
（1）对相应国家参考品（如有）检测的符合情况。
（2）最低检测限（分析灵敏度）：说明试剂的最低检测浓度或滴度，简单介绍最低检测限的确定方法。
（3） 企业内部阳性/阴性参考品符合率，简单介绍阳性参考品的来源、浓度梯度、阴性参考品组成、来源以及浓度梯度设置等信息。
（4） 精密度：精密度参考品的组分、浓度及评价标准。
（5） 分析特异性
①交叉反应：对易产生交叉反应的其他病原体的高水平IgM抗体、特异性IgG抗体等的验证情况。
②干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如溶血、高脂、黄疸等干扰因子研究（结果应量化表示，禁用轻度、严重等模糊表述），有关高浓度总IgM和IgG抗体、自身抗体、类风湿因子（RF）、嗜异型性抗体等的干扰验证。
③药物影响：较常见的用于病原体感染治疗的外用或内服药物对检测结果的影响。
（6）钩状（HOOK）效应：对高浓度特异性IgM抗体的钩状效应验证情况。
（7）对比试验研究（如有）：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。
9.【注意事项】应至少包括以下内容：
（1）有关试剂盒内人源组分（如有）生物安全性的警告。
（2）有关实验操作、样本保存及处理等其他注意事项。
拟定产品标准应符合国食药监械〔2007〕229号和国食药监械〔2007〕609号文件的相关规定。另外，对于国产试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。
病原体特异性IgM抗体检测试剂的注册检测应主要包括以下性能指标：物理性状、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、精密度、最低检测限（分析灵敏度）等。阳性参考品主要考察对不同滴度情况下的检测符合性。阴性参考品则是对分析特异性（交叉反应）的验证，应主要包括易发生交叉反应的其他病原体特异性IgM抗体的假阳性情况的考核。
如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。
（四）注册检测
根据国食药监械〔2007〕229号文件要求，首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家参考品的病原体特异性IgM抗体项目，在注册检测时应采用相应的国家参考品进行,对于目前尚无国家参考品的项目，生产企业应自行建立稳定的质控体系并提供相应的内部参考品。
1．试剂盒所用病原体抗原的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料，主要包括以下两方面：
（1）企业自制抗原
如为天然抗原，则应对病原体毒株选择、病原体培养、抗原提取及纯化、鉴定等实验过程予以详述；如为重组抗原，则应提交有关特定基因选择、基因序列、基因克隆、抗原表达及抗原纯化鉴定等详细内容，并对基因克隆的整个过程进行详述，如特定脱氧核糖核酸（DNA）分子的体外处理、重组连接、导入宿主细胞、宿主细胞繁殖以及重组子表达等实验过程。
（2）企业外购抗原，则应详述抗原的名称及生物学来源，外购方名称，提交外购方出具的抗原性能指标及检验证书，详述申请人对该抗原技术指标的要求以及申请人确定该抗原作为主要原材料的依据。供货商应相对固定，不得随意更换。
2．试剂盒所用抗体（如抗IgM-μ链抗体）的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料，主要包括以下两方面：
（1）企业自制抗体
如使用天然抗原作为免疫原则应明确该天然抗原的来源；如使用重组抗原或其他人工合成抗原作为免疫原，应提供相应的核酸组分及重组抗原的序列信息。申请人对所选抗体的技术指标要求（如外观、纯度、蛋白浓度、效价等），确定该抗体作为主要原材料的依据。
（2）企业外购抗体，应详述抗体的名称及生物学来源，外购方名称，提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书，详述申请人对该抗抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。供货商应相对固定，不得随意更换。
申请人应对主要生物原料质控标准的技术要求如外观、纯度、蛋白浓度、效价等进行确认，并对制备完成的抗原成品进行质量检验以确认其符合标准要求，整个生产工艺稳定可靠。
3.其他主要原辅料的选择及验证资料，如固相载体、硝酸纤维素膜、反应缓冲液等，该类原辅料一般均为外购，应详述每一原辅料的外购方名称，提交外购方出具的每一原辅料性能指标及检验证书，详述申请人对每一原辅料技术指标的要求以及申请人确定该原辅料作为主要原辅料的依据。
4．企业内部参考品的原料选择、制备、定值、统计学分析及相关的实验验证资料。应提供对参考品性质确认的其他方法或试剂（建议采用国内已上市的、临床上普遍认为质量较好的同类试剂）的相关信息。
1.主要生产工艺介绍，可用流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。
2.产品基本反应原理介绍。
3.包被工艺研究，申请人应考虑如包被液量、浓度、时间等指标对产品性能的影响，通过试验确定上述指标的最佳组合。
4.显色（发光）系统、酶作用底物等的介绍。
5.实验体系反应条件确定：申请人应考虑反应时间、反应温度、洗涤次数等条件对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。
6. 酶催化底物（发光或变色）的最适条件研究。
7.体系中样品加样方式及加样量确定：申请人应考虑样品加样方式、加样量对产品检测结果的影响，通过实验确定最佳的加样方式及加样量。如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，申请人还应对可用于样本稀释的基质或处理方法进行研究，通过试验确定最终选择的用于样本稀释的基质或处理方法。
企业应提交原厂在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、试验数据、统计分析等详细资料。对于病原体特异性IgM抗体检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。
1.最低检测限（分析灵敏度）
选取特定滴度的病原体特异性IgM抗体样本，做系列倍比稀释，将检测结果的阳性率在90%～95%（n≥20）的最大稀释倍数作为试剂盒的最低检测限。
2.分析特异性
（1）交叉反应
用于病原体特异性IgM抗体检测试剂交叉反应验证主要考虑以下几方面可能性：
①对抗原结构相近或临床症状相似的其他病原体高水平IgM抗体血清进行交叉反应研究，如乙型肝炎病毒核心抗体（HBc）IgM、甲型肝炎病毒（HAV）IgM、弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒以及巨细胞病毒IgM抗体等。
②高浓度病原体特异性IgG抗体与特异性IgM抗体的交叉反应验证。
申请人应提交所有用于交叉反应验证的病原体来源、浓度或滴度确认等信息。建议申请人将有关交叉反应验证的信息以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中列出。
（2）干扰物质
①内源性干扰
对样本中常见的内源性干扰物质进行检测，如溶血、高脂、黄疸、类风湿因子（RF）、抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）、高浓度非特异性IgG和IgM抗体（血清总IgG和IgM）等。方法为对病原体特异性IgM抗体阴性、弱阳性（临界浓度）的临床或模拟添加样本分别进行验证，样本量选择应体现一定的统计学意义，说明样本的制备方法及干扰实验的评价标准，确定可接受的干扰物质极限浓度。
②抗凝剂的干扰
如果试剂盒适用样本类型包括血浆样本，应采用各种适用抗凝剂抗凝的血浆样本分别与血清样本进行对比实验研究。方法为对不少于50例源自同一患者的病原体特异性IgM抗体阴性、弱阳性（略高于临界值）的血清和血浆样本（不同抗凝剂各50例）进行检测以验证申报试剂对于血清和血浆样本的检测结果的一致性。
③目前，病原体特异性IgM抗体检测试剂通常采用捕获法（又称双夹心法）和间接法两种原理。后者是将病原体抗原包被在固相载体上，加入含待测IgM抗体的样本后，待抗原抗体结合后，再加入酶标记的抗IgM抗体进行反应，孵育后洗去未结合的酶结合物再加入酶底物显色以反应“抗原-抗体-酶标二抗”复合物的存在。该方法在检测特异性IgM抗体时存在一定不足，由于血清中存在的IgM类类风湿因子能与IgG抗体结合，然后结合到酶标二抗上，易造成假阳性，高效价的病原体特异性IgG抗体也可与IgM抗体竞争抗原结合位点而导致假阴性。因此，采用间接法（固相包被病原体抗原）的试剂，需要在病原体特异性IgM检测前采用一定的方法去除样本中的IgG类抗体，例如，在样本缓冲液中加入抗人IgG抗体，可以特异性地结合血清或血浆中的IgG并沉淀，如果样本中存在类风湿因子，也将被抗人IgG-IgG的复合物所吸附而去除干扰。
基于上述理论，使用间接法原理的试剂盒，在样本处理环节应该设置一定的IgG消除体系以降低实验中假阳性或假阴性的可能性。如果反应体系中使用了相关的IgG吸附技术（IgG吸附剂）来去除类风湿因子、抗核抗体或病原体特异性IgG抗体的干扰，应以mg/dL为单位注明IgG吸附剂对样本中人IgG抗体的吸附能力，并进行以下的实验研究：对至少10份临界值附近的病原体特异性IgM抗体弱阳性并含有多水平病原体特异性IgG抗体的样本进行检测，比较去除总IgG前后的结果，验证IgG吸附剂消除干扰的效果，以上实验可以采用人工制备的样本进行。
④对至少10份含有病原体特异性IgM抗体的样本进行IgM破坏实验研究，方法为采用特定的化学制剂（如2－巯基乙醇或二硫苏糖醇）处理样本后，重新进行检测，IgM检测结果应为阴性。
5.精密度
企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等，针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
（1）对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂本身外，还应对操作者、实验地点等要素进行相关的验证。
（2）设定合理的精密度评价周期，如有条件，建议申请人选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
（3）用于精密度评价的质控品应至少包括三个水平:
①阴性质控品：待测物浓度低于试剂盒的临界值（cut-off value）或背景值较高的零浓度质控品，阴性检出率应为100%（n≥20）。
②弱阳性质控品：待测物浓度略高于试剂盒的临界值（cut-off value），阳性检出率应在90%～95%范围（n≥20）。
③阳性质控品：待测物浓度呈中到强阳性，阳性检出率为100%，且CV≤15%（n≥20）。
另外，建议选择适量临床采集的新鲜病人样本（包括所有样本类型）作为无靶值质控品进行精密度评价，以更好地模仿临床检测环境。
6.阳性/阴性参考品
如申报产品有相应的国家参考品，则企业内部阳性/阴性参考品应参考国家参考品的项目设置。在不低于国家参考品要求的前提下，申请人可以结合实际情况设置合理的内部阳性/阴性参考品。对于没有国家参考品的产品，申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品，阳性参考品应着重考虑抗体滴度要求，阴性参考品则主要涉及对分析特异性（交叉反应）的验证情况。
申请人应对内部阳性/阴性参考品的来源、抗体滴度等信息进行精确的实验验证，并提交详细的验证资料。
7.钩状（HOOK）效应
须采用高滴度的病原体特异性IgM抗体的血清进行梯度稀释后由低浓度至高浓度开始检测，每个梯度的稀释液重复3～5份，对钩状效应进行合理的验证。建议在产品说明书上明示对钩状效应的研究结果。
重点提交对申报试剂阴性/灰区/阳性等结果判断的临界值确定的实验研究资料，应包括具体的试验方案、评价标准、统计学分析、研究数据等研究资料。建议采用受试者工作特征曲线（ROC）的分析方式来选择确定合理的临界值，如实验结果分析存在灰区（equivocal zone），则应明确灰区建立的基础。临界值建立的样本来源选择应考虑到地域性、年龄、不同生理状态等因素的影响，并明确临界值在不同的样本类型是否有差异。对临界值建立后所产生的临床灵敏度和特异性进行充分判断，使产生假阴性或假阳性结果的可能性均降至最低。
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性、高温加速破坏稳定性、运输稳定性及开瓶稳定性（如涉及）等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
考虑到低温条件下长时间保存可能造成病原体特异性IgM抗体的活性减弱，申请人应对样本稳定性进行合理的验证，主要是对冷藏和冷冻两种条件下的有效期进行验证，以确认不同类型样本的短期、长期保存条件及效期。需要冷冻保存的样本应对冻融次数（重要指标）进行合理的验证。某些用于防腐、冷冻用途或起稳定保护作用的添加剂（如叠氮化物）可能会对IgM抗体的检测造成影响，如涉及，请对该添加剂的影响进行合理验证。
另外，如果要用于加热样本（如热灭活）的检测，则应对加热前后的病原体特异性IgM抗体阳性及阴性样本进行加热因素的干扰验证。方法为对临界值附近的至少10份弱阳性加热和未加热样本进行对比检测，比较检测结果的差异；对至少10份阴性加热和未加热的样本进行对比检测，比较检测结果的差异。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
1. 研究方法
（1）对于已有同类产品上市的试剂临床研究，选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。考虑到试剂盒的预期用途，阳性样本中应包括一定量的新鲜样本比例。
另外，申请人还应选择不少于30例、感染急性期患者采集的样本进行考核试剂与病原体分离培养鉴定方法的比较研究，以确定申报试剂检测结果与金标准方法比较的符合率并以此判断其临床灵敏度和特异性。如果病原体分离培养鉴定的方法不可行也可以采用其他用于感染急性期判断的方法进行比对研究，例如：病原体IgG抗体的血清学转换（动态监测2份或以上的血清IgG，恢复期与急性期比较IgG呈4倍以上升高）、病原体核酸检测或直接抗原检测等方法，对于病原体感染急性期的判断应密切结合患者的临床诊断综合进行。
（2）对于无同类产品上市的申报试剂的临床研究，则必须选择病原体感染检测的金标准方法并结合临床诊断进行相应的对比试验研究，如病原体分离培养鉴定、病原体IgG抗体的血清学转换、病原体核酸检测或直接抗原检测等方法。
2.临床研究单位的选择
申请人在国内不同区域选择临床单位，尽量使各单位的临床样本有一定的区域代表性；临床研究单位应具有特定病原体感染疾患诊疗、病原体分离培养鉴定方法或分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和参比方法都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
3.临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的参比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。另外，考核试剂的样本类型不应超越参比试剂对样本类型的检测要求，如果选择了参比试剂适用样本类型以外的样本，则应采用病原体分离培养鉴定或其他合理方法对额外的样本类型进行验证。
4.病例选择及样本类型
临床试验应选择具有特定病原体感染症状/体征、相似症状或有密切接触史等人群作为研究对象。企业在建立病例纳入标准时，应考虑到不同人群的差异，尽量覆盖各类适用人群。在进行结果统计分析时，除总体病例数的要求外，建议对各类人群分层进行数据统计分析。考虑到大样本统计学的要求，临床研究中病原体特异性IgM抗体的阳性样本例数以不少于120例为宜。对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应的需要，对靶病原体之外的其他病原体感染急性期的患者样本进行检测，以从临床角度考察其分析特异性。
5.统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、受试者工作特征（ROC）曲线分析、阴性/阳性符合率等。对于本类产品对比实验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计学分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
6.结果差异样本的验证
在数据收集过程中，对两种试剂检测结果明显不一致的样本，应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂（国内已上市）进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。如果申报试剂与参比试剂的检测结果显示不一致样本均是位于二者的临界值附近且例数很少（如低于总例数的1%），则对不一致原因作简要分析即可，不须进行第三方复核。注意，如果有必要选择第三方试剂复核，建议先采用第三方试剂对一定数量的申报试剂和参比试剂检测结果一致的样本（包括阳性和阴性结果）进行检测，以对第三方试剂选择的合理性进行评估。
7. 临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
（1）临床试验总体设计及方案描述
① 临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
② 病例纳入/排除标准、不同人群的预期选择例数及标准。
③ 样本类型，样本的收集、处理及保存等。
④ 统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
（2） 具体的临床试验情况
① 申报试剂和参比试剂的名称、批号、有效期等信息。
② 对各研究单位的病例数、人群分布情况进行综合，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
③ 质量控制，试验人员培训、质控品检测情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
④ 具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。
（3） 统计学分析
① 数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
② 定性结果的一致性分析
阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%（或99%）的置信区间。以交叉表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。另外考虑到对不同样本类型以及不同人群的检测结果可能存在一定差异，故建议对不同样本类型及不同人群分别进行统计分析， 以对考核试剂的临床性能进行综合分析。
（4） 讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
四、名词解释
1.分析特异性（analytical Specificity）：测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述，并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度。
注：潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物。
2.精密度（precision）：在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。
五、 参考文献
1.《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》，（国食药监械〔2007〕229号），2007年4月19日。
2.《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》，（国食药监械〔2007〕240号），2007年4月28日。
3.《体外诊断试剂说明书编写指导原则》，（国食药监械〔2007〕240号），2007年4月28日。
4.Review Criteria for In Vitro Diagnostic Devices for Detection of IgM Antibodies to Viral Agents, CDRH FDA, USA February 27, 1997。
5.National Committee for Clinical Laboratory Standards. Specifications for immunological testing for infectious diseases, proposed guideline. 2001. Order code I/LA18-A2。
6.彭文伟，《传染病学》，第五版，人民卫生出版社，2001。
7.刘艳芳、张勇建、苏明，临床病原体学检验，军事医学科学出版社，2009。
8.陈敬贤，《诊断病原体学》，第一版，人民卫生出版社，2008年4月。
9.冯仁丰，《临床检验质量管理技术基础》，第二版，上海科学技术文献出版社，2007年4月。
10.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社。
11．李洪源，王志玉，《病原体学检验》，第一版，人民卫生出版社，2006年7月。
12．Nathanson.N，《病原体致病与免疫》，第2版，科学出版社，2008年1月。
13．曹雪涛，《免疫学技术及其应用》，第一版，科学出版社，2010年5月。
酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则
酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则
一、前言
本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。
本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围
本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。
三、基本要求
（一）基本原则
1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。
3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。
4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。
5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。
（二）原材料质量控制
1.主要生物原料
与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。
主要生物原料的常规检验项目一般包括：
（1）外观
肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。
（2）纯度和分子量
主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳，一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。
（3）蛋白浓度
蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其他适宜的方法进行检测。
（4）效价
效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。
（5）功能性实验
功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。
2.生物辅料
生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：
（1） 牛血清或羊血清
外 观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物。
无菌试验：将血清直接37℃放置7天，明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。
总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量≥32mg/ml。
球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。
（2） 牛血清白蛋白：
外 观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。
溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃时，溶解时间应≤15分钟，pH值应为6.5~7.1。
总蛋白含量：用双缩脲法，其标准为≥95％。
总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。
BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。
（3） 酪蛋白：
应符合生产所需的质量标准。
（4）标记用酶
应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。
对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不能出现非特异性反应。
生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。
3.化学原材料
化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。
主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。
4.其他物料
（1） 酶标板
①外观
明亮处用肉眼观察板条的外观质量，如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。
②吸附能力和精密性
采用合适的方法进行检验。
一般用一定浓度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，使用酶标仪读数，计算CV值。CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％，批间CV≤10％。
（2）液体试剂装量瓶
包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。
（3）其他材料
包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。
5.企业质控品
企业质控品一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性、钩状效应（hook效应）等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。
（三）试剂盒各组分的生产
酶联免疫法检测试剂主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。
1.各种工作液的配制
酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。
各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。
应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。
2.包被酶标反应板
包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。
选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内置干燥剂），保存于2~8℃。
应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。
3.分装和包装
样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行过滤后再分装，分装量的误差应小于5%。
分装及包装均应按照相应的标准操作规程要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。
（四）质量控制
1.半成品质量控制
（1）半成品抽样
检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。
（2）半成品检验
根据试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验。
半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
检验指标一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应的质量标准要求。对于精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和定量质控品检测结果的准确性。
企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，2~8℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。
2.成品质量控制
产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。
每一批酶联免疫类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。
（1）成品检验
成品检验时，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
（2）稳定性试验
在批放行前，每一批试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。
四、名词解释
酶联免疫法：是指在酶标板上包被特定的抗原（和/或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（和/或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体和/或抗原的存在。
五、参考文献：
1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社
金标类检测试剂注册技术审查指导原则
金标类检测试剂注册技术审查指导原则
一、前言
本指导原则主要针对金标类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。
本指导原则系对金标类检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围
本指导原则适用于第三类体外诊断试剂中金标类试剂的注册技术审查，其他类金标试剂可作参考。
三、基本要求
（一）基本原则
1.诊断试剂的研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量指标，并应符合有关法规的要求。
2.诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生产企业还应该通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。
3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。
4.研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。
5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。
（二）原材料质量控制
1.主要生物原料
与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆杭体、多克隆抗体以及多肽类生物原科。这类原料可用于胶体金标记、包被硝酸纤维膜及用于制备质控线的抗原或抗体等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。
主要生物原料的常规检验项目一般包括：
（1）外观
肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。
（2）纯度和分子量
主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜的聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为5μg；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。
（3）蛋白浓度
蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。
（4）效价
效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。
（5）功能性实验
功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。用于制备质控线的抗原或抗体可采用其他适宜方法进行功能性实验。
2.生物辅料
生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》规定的质量标准要求并检验合格，达到相应的质量标准后方可用于生产。
建议对牛血清白蛋白作以下检验：
外观：应为浅黄色、黄色或乳白色冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其他杂质颗粒。
溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18~26℃时应不大于15分钟，pH值应为6.5~7.1。
总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，其标准为大于等于95%。
总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。
BSA的净含量：总蛋白含量乘以总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。
生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。
3.化学原材料
化学原材料的质量标准参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。
主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。
4.其他物料
硝酸纤维素膜、玻璃纤维或聚酯纤维膜及滤纸、玻璃纤维膜等在购入时，其生产商必须提供该批次材料的质量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。
（1）硝酸纤维素膜
硝酸纤维素膜应具有厚度、孔径大小等要求，毛细迁移速度，韧性（切割时膜破损引起的废品率）、均一性（厚度偏差范围、毛细迁移速度偏差范围）应达到规定的要求。
（2）玻璃纤维或聚酯纤维膜及滤纸
玻璃纤维或聚酯纤维膜及滤纸应具有厚度、毛细迁移速度、重量等要求，均一性（厚度偏差范围，毛细迁移速度偏差范围，重量偏差范围）应达到规定的要求。
（3）玻璃纤维膜
适用于全血检测的金标试剂，过滤红细胞所用玻璃纤维膜或其他材料具有不吸附蛋白质的特点，应具有厚度、孔径大小等要求。
（4）塑料衬片
塑料衬片应具有厚度、硬度（切割时一次未能整条切下的百分率）、尺寸（与标识吻合）、粘性（切割时造成玻璃纤维与塑料衬片分离的百分率）等要求。
（5）其他
粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等，应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。
（三）试剂盒的制备
本类试剂的生产包括胶体金及胶体金标记抗原或抗体的制备，胶体金标记的包被，检测线及质控线的制备，胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定，各种工作溶液的配置等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。
1.胶体金标记物的制备
采用枸橼酸三钠还原法或其他方法制备胶体金，胶体金颗粒大小应符合规定，胶体金标记物在510~560nm波长处应有最大吸收值，置2~8℃保存，应在规定的保存期内使用。采用合适的方法确定胶体金标记物、包被抗原或抗体工作浓度，将工作浓度的胶体金标记物吸附于玻璃纤维或聚酯纤维膜上。
2.检测线及质控线的制备
取已确定使用浓度的相关抗原或抗体，在硝酸纤维素膜上制备检测线，应用同样方法制备质控线，根据生产工艺在规定的温度、湿度条件下干燥，置规定的湿度（通过验证方法确定相对湿度要求）条件下存放。检测线与质控线应具有间隔距离要求，应对所用的金标用玻璃纤维及硝酸纤维素膜等进行质量检测，如尺寸、外观、包装及吸附性能等，并记录批号、数目、标识，不同批号的玻璃纤维及硝酸纤维素膜不能混用。
3.贴膜、切割、装袋
贴膜、切割及装袋应在具有相应湿度（通过验证方法确定相对湿度要求）条件下操作，切割的膜条应有宽度要求。
（四）质量控制
用于半成品及成品质量控制的质控品包括灵敏度、特异性、精密度等指标，如具有国家标准品（参考品）的产品应使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化的企业参考品进行检验。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
1.半成品质量控制
（1）半成品抽样
检验人员按批号抽取规定数量的半成品，作号标记，待检。
（2）半成品检验
对所抽样的半成品做阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度等试剂盒性能方面的检测，应符合质量标准。
企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究，并制定相应的质量标准。稳定性试验可在在特定温度或特定条件下完成。
2.成品质量控制
每一批金标类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。
一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
（1）物理检查
应进行外观是否平整，材料附着是否牢固，液体移行速度，膜条宽度等物理检查，应符合质量标准。
（2）性能方面的检测
阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度等试剂盒性能方面的检测，应符合质量标准。
每批试剂批放行前，应完成稳定性试验，并达到相应的质量标准。稳定性试验可在特定温度或特定条件下完成。
四、名词解释
金标类检测试剂：利用胶体金免疫技术，采用胶体金标记的抗体或抗原包被于玻璃纤维膜、聚脂膜或其他载体，将相关抗原或抗体固相连接在硝酸纤维膜，应用层析法的原理检测样品中的抗原或抗体的快速检测试剂。
五、参考文献：
1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社
肿瘤标志物类定量检测试剂注册申报指导原则
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肿瘤标志物类定量检测试剂注册申报指导原则（征求意见稿） |
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2009-08-27 11:00 |
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一、前言
六、起草单位 |
核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则
附件3
核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则
一、前言
本指导原则主要针对核酸扩增类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。
本指导原则系对核酸扩增法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围
本指导原则适用于核酸扩增法检测试剂的注册技术审查，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。
三、基本要求
（一）基本原则
1.核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2．试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。
3.试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。
4.核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。
5.企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。使用未列入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。
（二）原材料
应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。主要原材料（包括生产工艺）或其供应商发生变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。
核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
1.脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。应为高效液相色谱（HPLC）纯、PCR级，无DNase和RNase污染。—20℃保存。
2.引物
由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用脱氧核糖核酸（DNA）合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。
冻干粉，序列正确，合成量应达到试剂生产要求。纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。
应作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之间，可视为合格引物。-20℃保存。
3.探针
是指特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5'-端(和/或3'-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化。
冻干粉，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。应以可见—紫外分光光度计进行200—800nm扫描，在260nm处应有吸收峰。另外，根据标记荧光素的不同，还应该在荧光素的激发波长处有吸收峰，如FAM荧光素在494nm、TET荧光素在521nm、TAMRA荧光素在560nm处有特异的吸收峰，杂交探针在493nm、625nm、685nm处有特异的吸收峰，检定合格后入库。避光、-20℃保存。
4.DNA聚合酶
如Taq DNA聚合酶。应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50%活性。-20℃保存。
5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）
具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，IU UNG在 37℃处理3分钟后，103拷贝以下含U模板应完全降解，不能产生扩增产物。-20℃保存。
6.逆转录酶
具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。—20℃保存。
（三）生产工艺
核酸扩增类检测试剂的基本生产工艺通常包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。
工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、临界值的确定、稳定性和有效期，提供确切的依据。
（四）质量控制
1.半成品质量控制
（1）按批号抽取规定数量的半成品。
（2）以参考品/对照品进行半成品质量控制。如果产品具有国家标准品或参考品，应以其进行检定。如果产品不具有国家标准品或参考品，应根据规定制备相应的企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
（3）半成品检定内容包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度。检测结果应符合质量标准的要求。
（4）半成品检定合格后，按试剂盒组成及时进行分装和包装。
2.成品质量控制
（1）每一批核酸扩增法检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。
（2）产品完成包装后，应根据生产量进行抽样和生产记录审核。
（3）以参考品/对照品进行成品质量检验。结果应符合要求。
（4）成品检验的内容应包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度、线性范围（定量产品）和稳定性。
5．试剂批放行前，应对需要进行稳定性考核的试剂成分，在特定温度或条件下进行稳定性试验。稳定性试验可采用加速破坏试验。
四、名词解释
核酸扩增法检测试剂：核酸扩增技术泛指以扩增脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）为手段，检测特定核酸序列或筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸扩增法检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。
五、参考文献
1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社
发光免疫类检测试剂注册技术审查指导原则
附件2
发光免疫类检测试剂注册技术审查指导原则
一、前言
本指导原则主要针对发光免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。
本指导原则系对发光免疫类检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围
该指导原则主要适用于利用发光免疫分析技术对蛋白质等被测物质进行检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查，第二类试剂的生产及质量控制可参考该指导原则执行
三、基本要求
（一）基本原则
1.研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。
2.诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生产企业还应该通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。
3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。
4.研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。
5.试剂生产和质量控制的总体目标：保证产品使用安全，质量稳定，工艺可控，使用有效。
（二）原材料质量控制
1.主要生物原料
与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。一般按工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。
主要生物原料的常规检验项目一般包括：
（1）外观
肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。
（2）纯度和分子量
主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。
（3）蛋白浓度
蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。
（4）效价
效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。
（5）功能性实验
功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。
2.生物辅料
生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。
建议作以下检验：
（1） 牛血清或羊血清
外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物
无菌试验：将血清直接37℃度放置7天，放在明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。
总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量不小于32mg/ml。
球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。
（2） 牛血清白蛋白：
外观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其他杂质颗粒。
溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃时，溶解时间应不大于15分钟。1%牛血清白蛋白水溶液的pH值应为6.5~7.1。
总蛋白含量：用双缩脲方测定，质量标准为≥95％。
总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。
BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量，其标准为≥90%。
（3） 酪蛋白：
酸度应符合生产所需的质量标准。
（4）标记用酶
应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。
对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。
生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。
3.化学原材料
化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、重金属检测、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。
（1）无机类：主要包括有氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氯钠等。
（2）有机类：主要包括有吐温20、三羟基氨基甲烷等。
（3）特殊化学原料：铕-DTTA，鲁米诺等。
铕-DTTA纯度分析与鉴定：要求铕-DTTA各功能团符合分子结构，纯度在96%以上。
4.其他原辅料
（1）微孔板条
外观：明亮处用肉眼观察板条的外观质量应无划痕、破损、飞边、肮脏、表面光滑。板条与微孔反应条塑料框架应配合合适。
材质：微孔反应板条每孔加200µL增强液，用发光免疫分析仪检测其荧光值，平均本底荧光值≤1500。
吸附能力和精密性：用一定浓度的蛋白包被微孔板条，检测荧光值，CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％,批间CV≤10％。
（2）其他
粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。
（三）试剂盒各组分的生产
发光免疫分析试剂主要组分的生产包括包被反应板、标记物制备、各种溶液的配置、冻干、分包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。
1.固相载体的制备（因不同产品使用的包被载体有很大区别，在此以标准96孔微孔反应板为例进行描述）
（1）包被板的准备
准备经检验合格的包被板，记录批号、数目、状态标识。
质控项目：尺寸、外观、包装。
（2）包被液的配制
配制包被缓冲液，加入包被的抗体或抗原至工作浓度，混合均匀，即成所需的包被液，工作浓度的包被液应在规定时间内使用。
质控项目：包被缓冲液配方、pH值、包被物成分。
（3）包被板的包被
包被液按工艺要求加入包被板。记录所包被的包被板数量。
质控项目：包被体积、温度、时间、过程监控。
（4）洗板工作液的配制（按各单位工艺要求，可以不洗板）
按配方配制洗板工作液。
质控项目：洗板工作液配方、pH值。
（5）封闭液的配制
按配方配制封闭液。
质控项目：封闭液配方、pH值。
（6）洗板和封闭
包被完成后，抽去孔内包被液，用洗板工作液洗板后（按各单位工艺要求，可以不洗板），加入封闭液。
质控项目：封闭体积、温度、时间、过程监控。
质检项目：封闭前检验包被均一性。
（7）抽干
封闭后的反应板，抽干孔内液体。
质控项目：过程监控。
（8）干燥
反应板应按工艺的要求进行干燥。
质控项目：温度、湿度、时间、过程监控等。
（9）密封包装
将干燥后的反应板用铝箔袋密封包装，内放干燥剂（按各单位工艺要求，可以不放）。
质控项目：密封性能、标示及效期等。
（10）反应板（半成品）检验
对装袋密封后的反应板进行抽样检验，外观、板内变异、板间变异。
2.滴配过程
（1）酶结合物的制备（根据各产品实际情况，该步骤可不进行）
采用常规过碘酸钠——乙二醇法将相关的抗体（或抗原）标记辣根过氧化物酶（或其他酶），酶标记后的抗体（或抗原）应加入适当的保护剂保存于低温。
质控项目：标记方法、过程控制。
（2） 酶结合物的鉴定
①功能性实验
将酶结合物用酶稀释液稀释后，用于产品的滴配，其结果应符合相关试剂盒的质量标准。
② 稳定性
将酶结合物用酶稀释液稀释，进行2~8℃热稳定性实验，滴配结果应符合相关试剂盒的质量标准。
（3）酶结合物稀释液
按酶结合物稀释液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于规定时间内使用。
质控项目：酶结合物稀释液配方、pH值。
（4）酶结合物工作浓度的滴配
取酶结合物，用酶结合物稀释液稀释到不同的浓度，用已制备好的反应板进行滴配。测定系列标准品及相应的质控品，确定使体系达到最优的酶结合物工作浓度。
（5）酶结合物工作液配制
将所需量酶结合物和酶结合物稀释液按滴配浓度混合均匀。
质检项目：分装前检验，用配套的反应板进行检验，外观、灵敏度、质控品测定值、定量产品应作校准品线性检测。
（6）酶结合物工作液的分装
按工艺要求分装酶结合物工作液。
质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。
（7）酶结合物工作液（半成品）检验
对分装后的酶结合物工作液进行抽样检验，外观、分装量、灵敏度、校准品剂量-反应曲线线性、质控品测定值。
3. 校准品、阴/阳性对照或质控品的制备
（1）稀释液
按稀释液的配方配制，存放在2~8℃或-20℃保存，并于有效期内使用。
质控项目：稀释液配方、pH值。
（2）校准品、阴/阳性对照或质控品的配制
校准品、阴/阳性对照或质控品的配制应具有量值溯源性，可参照国家标准品、世界卫生组织标准品或其他级别的标准物质进行配制。
质检项目：分装前检验，准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。
（3）校准品、阴/阳性对照或质控品的分装
按工艺要求分装校准品、阴/阳性对照或质控品。
质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量。
（4）校准品、阴/阳性对照或质控品（半成品）检验
对分装后的校准品、阴/阳性对照或质控品进行抽样检验，外观、分装量、准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。
4.化学发光底物的制备
（1）底物缓冲液
按底物缓冲液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于有效期内使用。
质控项目：底物缓冲液配方、pH值。
（2）化学发光底物（氧化剂和发光剂）的配制
分别按氧化剂和发光剂的配方在底物缓冲液中加入相应的氧化剂和发光剂
质控项目：氧化剂和发光剂配方。
质检项目：分装前检验，本底、发光强度。
（3）化学发光底物（氧化剂和发光剂）的分装
按工艺要求分装化学发光底物（氧化剂和发光剂）。
质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。
（4）化学发光底物（半成品）检验
对分装后的化学发光底物进行抽样检验，外观、分装量、本底、灵敏度、发光强度。
5.铕标记物的制备
针对不同的标记生物原料，确定不同的标记制备工艺，包括铕-DTTA与标记生物原料的比例，标记温度和标记时间、标记得率的计算标准等。在实际操作过程中要求严格按照标准操作规程进行操作
6.冻干
各种冻干品都需建立各自的冻干工艺，冻干品外观应该呈现疏松的粉末状固体，具有一定的形状，复溶完全、迅速，呈澄清透明液体。
7.分装、灯检和贴签
分装量用减重称量法进行测量，把质量换算成体积后进行分装量的控制。灯检是目测检查各组分的色泽、分装量以及是否混浊、有杂质等。
8.包装
根据试剂盒包装标准操作规程及说明书的要求，以流水线操作形式进行包装。包装时应严格检查品名、批号、装量，认真核对各物料数量，并在关盒前进行复核。
（四）质量控制
1.半成品质量控制
（1）半成品抽样
检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。
（2）质控品的要求
用于半成品质量控制的质控品包括阴/阳性样品符合率、灵敏度（最低检出量）、特异性、检测范围、定量曲线的线性、精密性、稳定性等指标，如具有国家标准品或参考品的产品应使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化的企业参考品进行检验。如无国家标准品（参考品），可采用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
（3）半成品检验
根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性等，均应达到相应的质量标准。
企业应对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，2~8℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。
2.成品质量控制
（1）成品抽样
产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。
每一批发光免疫类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。
（2）成品检验
一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到国家标准品（参考品）的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。
在批放行前，每一批发光类诊断试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。
四、名词解释
发光免疫类检测试剂：根据特异性抗原抗体反应等生物学原理，利用发光信号的强弱对样本中相应抗原或抗体进行定性或定量检测的一类试剂。主要包括化学发光（酶促、非酶促），电化学发光和时间分辨荧光等法。
五、参考文献
1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社
关于印发医疗器械生物学评价和审查指南的通知
关于印发医疗器械生物学评价和审查指南的通知
国食药监械[2007]345号
2007-06-27 09:00
各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）：
为规范医疗器械生物学评价和审查工作，我局组织制定了《医疗器械生物学评价和审查指南》。现印发给你们，请参照执行，并将有关事项通知如下：
一、申请涉及生物学评价的产品注册的企业，可提供生物学评价报告（含支持性文件）代替产品注册检验报告中的生物学试验部分，或进行全项生物学试验。
二、国外企业提供的医疗器械生物学评价报告中含有生物学试验报告的，企业应提供生物学试验室所在国的GLP证明。
附件：1．医疗器械生物学评价和审查指南
2．《医疗器械生物学评价报告》的出具与审查要点
国家食品药品监督管理局
二○○七年六月十五日
附件1：
医疗器械生物学评价和审查指南
一、目的与范围
为使GB/T 16886－ISO 10993系列标准能够正确而有效地实施，特制定本指南。
本指南为医疗器械评价者提供了生物学评价指南，为医疗器械的审查提供了生物安全性审查指南。
注：本指南不涉及微生物污染、灭菌（如“无菌”、“细菌内毒素”）、除菌和动物源性医疗器械的病毒去除与控制等方面的生物安全性。
二、术语
（一）医疗器械：同《医疗器械管理管理条例》。
（二）制造者：医疗器械制造者或商标持有人/单位。
（三）评价者：医疗器械制造者或受其委托的专家。
注：医疗器械制造者对生物安全性评价负责。
（四）审查者：对医疗器械管理负有职责的行政管理部门或受其委托负责医疗器械审查的机构。
三、医疗器械/材料首次生物安全性评价
（一）评价依据
GB/T 16886－ISO 10993《医疗器械生物学评价》系列标准。
（二）评价者
应当经过培训并在医疗器械生物学评价方面具有长期实践经验。
（三）评价要求
1．出于保护人类的目的，需要进行生物学评价的医疗器械，生物学评价（特别是必要的动物试验）未开展之前不得进入临床试验。
2．对医疗器械开展生物学评价时，应当按照GB/T 16886.1－ISO 10993.1给出的评价流程图开展。
3．评价者在进行生物学评价过程中应当注重运用已有信息（包括材料、文献资料、体外和体内试验数据、临床经验），不应当局限在生物学试验上。
4．当生物学评价确定需要进行生物学试验时，应当委托有相应生物学试验资质的检验机构来进行。
5．在进行生物学试验时，应当：
（1）在进行动物试验前，先进行体外试验；
（2）按要求充分并合理地利用试验动物资源，优化试验方案，降低试验成本。
6．应当按GB/T 16886－ISO 10993系列标准对报告的要求，出具《生物学试验报告》。
注：生物学试验报告可不与型式检验报告一起出具。
7．《生物学评价报告》可以考虑（但不限于）包括以下方面：
（1）医疗器械生物学评价的策略和所含程序；
（2）医疗器械所用材料选择的描述；
（3）材料表征
－医疗器械材料的定性与定量的说明或分析
－医疗器械材料与市售产品的等同性比较
（4）选择或放弃生物学试验的理由和论证；
（5）已有数据和试验结果的汇总；
（6）完成生物学评价所需的其他数据。
四、医疗器械生物安全性重新评价
（一）在下列情况下，制造者应当考虑进行生物安全性重新评价：
1．制造产品所用材料来源或技术条件改变时；
2．产品配方、工艺、初级包装或灭菌改变时；
3．贮存期内最终产品发生变化时；
4．产品用途改变时；
5．有迹象表明产品用于人体会产生不良反应时。
若企业提交了没有发生第四条第（一）款所规定的重新评价情况的声明，在该产品重新注册时，可不要求重新开展和补充开展生物学评价。当产品的国家标准、行业标准和GB/T 16886－ISO 10993的系列标准重新修订后，若企业提交了没有发生第四条第（一）款规定的情况的声明，在该产品重新注册时，不要求补充生物学评价。
（二）重新评价时应当尽量利用临床评价信息、临床研究信息以及临床不良事件信息来进行。
重新评价应当在以往评价所形成文件的基础上开展，以避免重复不必要的生物学试验。重新评价应当按照第三条规定的程序进行。视具体情况，重新评价可以是全面的，也可以针对某一方面，但评价内容应当形成文件。
五、医疗器械生物安全性审查
（一）审查人员
审查者应当接受过GB/T 16886标准的培训。
（二）审查依据
GB/T 16886－ISO 10993《医疗器械生物学评价》系列标准。
（三）审查要求
1．应当根据产品使用说明书中所述的用途和产品的生物学危害的风险大小确定生物安全性审查严格度，必要时应当听取专家组的意见。
2．审查对象主要是《医疗器械生物学评价报告》。
3．作为生物学审查的输出，对所出具的每项审查结论，应当尽可能引证GB/T 16886.1－ISO 10993.1中的相应条款。
注：《医疗器械生物学评价报告》的出具与审查要点详见附件2。
附件2：
《医疗器械生物学评价报告》的出具与审查要点
一、医疗器械生物学评价的策略和所含程序
医疗器械生物学评价程序应当按GB/T 16886.1－ISO 10993.1给出的评价流程图开展。由于医疗器械的多样性和特殊性，各医疗器械在按流程图进行生物学评价时，实际产品在流程图中所走的路线是不一致的，应当对所走的路线予以详细说明。
二、医疗器械所用材料的描述
三、材料表征
（一）医疗器械材料的定性与定量的说明或分析
审查者了解医疗器械材料的成分信息，是审查决策的前提。制造者有义务对医疗器械所选材料的配方和/或来源给予详细的说明。至少从以下一个方面获取材料的信息：
1．公认的材料化学名称；
2．材料理化特性信息；
3．从材料的供应方获取材料的成分信息；
4．从医疗器械的加工方获取加工助剂的成分信息；
5．化学分析；
6．有关标准。
注：采用经过主管部门认可、并有标准可依的材料，比未得到认可的材料更具有生物安全性保证。
（二）医疗器械/材料与市售产品的等同性比较
与上市产品进行等同性比较的目的，是期望证明该产品与上市产品具有相同的生物安全性，从而为确定该产品的生物学评价和/或试验是否可以减化或免除。
产品的等同性比较主要分为两方面的比较。首先是比较材料和产品的用途是否等同，由于医疗器械的材料与用途对其生物安全性起决定性作用，如果能够证明注册产品材料和用途与上市产品具有等同性，就表明注册产品具有最基本的生物安全保证。但这还不足以证明注册产品与上市产品具有完全的等同性，还应当证明两者的生产过程（加工过程、灭菌过程、包装等）是否相同，因为生产过程也可能会引入新的有害物质（灭菌剂、加工助剂、脱模剂等残留物）。
与同类产品、材料、生产过程进行等同性比较，不是单指比较两个材料是否完全等同，而应当从毒理学等同性进行比较。与同类产品材料比较的原则是，所选用的材料和生产过程引入物质的毒理学或生物安全性不低于同类临床可接受材料的生物安全性。注册医疗器械和/或材料与已上市医疗器械和/或材料是否具有等同性，需要提供相应的证据。ISO 10993-18给出的以下示例都能表明生物学等同性：
1．拟用材料的成分和可溶出物与临床已确立材料等同；
2．拟用材料与现行标准规定材料的一致性及拟用材料符合现行标准中规定的用途、接触时间和程度；
3．拟用材料具有比其拟用接触方式更高接触程度的临床应用史；
4．拟用材料的可溶出物限量不超过GB/T 16886.17－ISO 10993.17规定的允许极限；
5．拟用材料中含有的化学物质或残留物比其拟取代的临床已确立材料更具毒理学安全性（假定接触相似）；
6．拟用材料中含有的化学物质或残留物与其拟取代的临床已确立材料具有相同的毒理学安全性（假定接触相似）；
7．拟用材料与临床已确立材料的可溶出物成分种类和数量不变,唯一区别是前者中的添加剂、污染物或残留物已经去除或比后者有所减少；
8．拟用材料与临床已确立材料的可溶出物相对量没有增加, 唯一区别是前者使用了比后者更能降低可溶出物水平的加工条件。
注：与自家生产的上市产品进行比较，往往比与他家生产上市产品进行比较更现实、更具可操作性。
四、选择或放弃生物学试验的理由和论证
评价可包括有关经验研究和实际试验。如果设计中医疗器械的材料在具体应用中具有可论证的使用史，采用这样的评价，其结果可能不必再进行试验。
由于医疗器械的多样性, 对任何一种医疗器械而言，GB/T16886.1－ISO 10993.1表1和表2中推荐的试验并非都是必须的或可行的，应当根据医疗器械的具体情况考虑应做的试验，表中未提到的其他试验也可能是必须做的。
应当对所考虑的试验、选择和/或放弃试验的理由进行记录并形成文件。资料性数据和材料的历史试验数据都可以作为放弃的理由，但要附这些数据。
五、已有数据和试验结果的汇总
（一）国内外相关文献检索与评审
医疗器械生物安全性的资料检索是提高评价质量的重要前提。在开展资料检索和文献评价的基础上，由具有理论知识和实验经验的生物学专家开展的医疗器械的生物学评价的效率为最高。因此，相关生物学文件检索的数量的多与少，是体现医疗器械生物学评价结论可靠性和程序正确性的重要方面。
（二）已经开展过的生物学试验报告和新开展的生物学试验报告（如果有）
生物学试验应当由有生物学试验资质的机构按GB/T 16886－ISO 10993系列标准规定进行并出具报告。
六、完成生物学评价所需的其他数据
（一）按标准进行的检验数据
用化学分析数据（定量与定性）和物理表征数据（如密度、硬度、拉伸强度等）等表征材料具有一致性的型式检验和日常检验数据。
（二）相关临床使用信息和/或临床研究结论
目前的生物学试验都依赖于动物模型，材料在动物体内出现的组织反应，在人体内不一定出现同样的反应。即使是已证实是最好的材料，由于人体间的差异，也会在某些人身上产生不良反应。因此，医疗器械通过了生物学评价后，还要进一步通过临床, 验证其人体应用的安全性。因此，在医疗器械已经有临床评价数据的情况下，充分利用临床数据进行生物学安全性评价是提高评价质量的重要方式。对已经有临床研究数据的医疗器械，对其进行生物学再评价时，应当充分利用已获取的临床信息进行评价，而不再要求用动物进行评价。
医疗器械/材料的临床数据主要来自于（如果有）：
1．国内外相关该医疗器械/材料的临床研究报道；
2．该医疗器械在上市前按《医疗器械临床试验规定》开展的医疗器械临床研究；
3．该医疗器械上市后从临床中获取的数据，包括医疗器械不良反应事件的报道和报告。
关于含有牛、羊源性材料医疗器械注册有关事宜
为防止牛海绵状脑病（以下简称疯牛病）通过使用医疗器械途径传入我国，国家药品监督管理局曾于2002年3月22日发布《关于禁止从发生疯牛病的国家或者地区进口和销售含有牛羊组织的医疗器械产品的公告》（国药监械〔2002〕112号），对含有牛羊组织的医疗器械产品进口和销售问题作出了规定。为进一步明确含有牛、羊源性材料医疗器械的注册，现对有关事宜公告如下：
一、直接作用于人体的医疗器械：
（一）凡产品中含有来自于发生疯牛病国家或地区（以下简称疯牛病疫情国家或地区）的牛、羊源性材料的，注册申请不予受理。
（二）产品中含有牛、羊源性材料，所含牛、羊源性材料并非来自于疯牛病疫情国家或地区，但产品实际生产场地在疯牛病疫情国家或地区的，分以下3种情况：
1．对取材于添加以哺乳动物为来源的蛋白质饲料喂养的牛、羊的组织及其衍生物的医疗器械，注册申请不予受理。
2．对取材于与来自疯牛病疫情国家或地区的牛、羊一起圈养的牛、羊组织及其衍生物的医疗器械，注册申请不予受理。
3．不属于上述1、2条所述情形的医疗器械，注册申请可予受理。申请注册时，应提供疯牛病传播的风险评估以及相应的控制措施等技术文件，说明产品不存在传播疯牛病的风险。通过技术审评决定是否予以注册。
（三）产品中含有牛、羊源性材料，但材料并非来自于疯牛病疫情国家或地区，产品的生产也不是在疯牛病疫情国家或地区完成的，注册申请可予受理。申请注册时，应提供疯牛病传播的风险评估以及相应的控制措施等技术文件，说明产品不存在传播疯牛病的风险。通过技术审评决定是否予以注册。
二、非直接用于人体的医疗器械（例如：牛皮面料的CT诊断床或牙科治疗椅）：
产品中含有牛、羊源性材料的，不论其牛、羊源性材料是否来自于疯牛病疫情国家或地区，注册申请可予受理。申请注册时，应提供文件，说明产品不存在传播疯牛病的风险。通过技术审评决定是否予以注册。
三、上述一、二条规定不适用于体外诊断试剂产品。体外诊断试剂产品中含有牛、羊源性材料的，注册申请可予受理。为保证产品在运输、使用过程中对接触者和环境的安全，申请注册时，应提供有关保证产品在运输、使用过程中对接触者和环境的安全的说明。通过技术审评决定是否予以注册。
四、根据国家质量监督检验检疫总局2006年6月22日更新的《禁止从动物疫病流行国家/地区输入的动物及其产品一览表》中所列出的国家/地区和疫病，截至本公告发布之日，本公告所指疯牛病疫情国家或地区包括下列国家或地区：以色列、日本、阿曼、意大利、葡萄牙、西班牙、英国、荷兰、比利时、法国、丹麦、爱尔兰、瑞士、德国、卢森堡、捷克、列支敦士登、斯洛伐克、斯洛文尼亚、奥地利、波兰、芬兰、整个欧盟、美国、加拿大。本公告所指疯牛病疫情国家或地区以国家质量监督检验检疫总局最新更新的《禁止从动物疫病流行国家/地区输入的动物及其产品一览表》中涉及疯牛病的国家/地区为准。
五、本公告适用于境内医疗器械和境外医疗器械。
六、自本公告发布之日起，相关生产企业或其代理人应对已进入中国市场的医疗器械进行自查，如有涉及本公告中不予受理注册的医疗器械的，应自行从市场上将该类产品全部召回，最迟不得超过2006年12月31日。
七、本公告发布后，注册时尚不属于不予受理注册的产品，因被列为新增疯牛病疫情家或地区而成为不予受理注册的产品的，已取得的医疗器械注册证书自行失效，相关产品不得在中国市场销售和使用。
八、本公告发布之日起，国家药品监督管理局2002年3月22日发布的《关于禁止从发生疯牛病的国家或者地区进口和销售含有牛羊组织的医疗器械产品的公告》同时废止。此前已发布的相关规定如有与本公告不符的，均以本公告为准。
国家食品药品监督管理局
二○○六年八月二日